1 適用范圍
本方法規(guī)定了采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定化妝品中7種禁用物質(zhì)：米諾地爾（CAS：38304-91-5）、氫化可的松（CAS：50-23-7）、螺內(nèi)酯（CAS：52-01-7），雌酮（CAS：53-16-7）、坎利酮（CAS：976-71-6）、醋酸曲安奈德（CAS：3870-07-3）、黃體酮（CAS：57-83-0）的方法。
本方法適用化妝品中禁用物質(zhì)：米諾地爾、氫化可的松、螺內(nèi)酯、雌酮、坎利酮、醋酸曲安奈德、黃體酮含量的測定。 2 方法提要
樣品經(jīng)過提取后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，以多反應(yīng)離子監(jiān)測模式進(jìn)行監(jiān)測，采用特征離子豐度比進(jìn)行定性，待測化合物峰面積定量，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算含量。本方法的檢出限、定量限和取樣品1 g時的檢出濃度、定量濃度見表1.
表1 各違禁成分的檢出限和檢出濃度 化合物 | 檢出限（ng/mL） | 定量限（ng/mL） | 檢出濃度(ng/g) | 定量濃度(ng/g) | 米諾地爾 | 0.2 | 0.5 | 2 | 5 | 氫化可的松 | 1 | 2 | 10 | 20 | 螺內(nèi)酯 | 1 | 2 | 10 | 20 | 雌酮 | 5 | 10 | 50 | 100 | 坎利酮 | 1 | 2 | 10 | 20 | 醋酸曲安奈德 | 0.2 | 0.5 | 2 | 5 | 黃體酮 | 0.5 | 1 | 5 | 10 |
3 試劑和材料
除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，水為去離子水。
3.1 乙腈，色譜純。
3.2 甲醇，色譜純。
3.3 乙腈溶液[φ（乙腈）= 90%]：量取10 mL水于100 mL量瓶中，加乙腈（3.1）稀釋至刻度，混勻。
3.4 米諾地爾、氫化可的松、螺內(nèi)酯、雌酮、坎利酮、醋酸曲安奈德、黃體酮對照品，由中國食品藥品檢定研究院提供。
3.5 混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液[r（待測成分）= 1 mg/mL]：精密稱取米諾地爾、氫化可的松、螺內(nèi)酯、雌酮、坎利酮、醋酸曲安奈德、黃體酮對照品10 mg（精確至0. 1 mg）置于同一10 mL量瓶中，加甲醇（3.2）使溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。
3.6 系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液：用90%乙腈（3.5）稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，精密配制得質(zhì)量濃度為10、20、50、100、200、500、1000、1500 ng/mL的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。
4 儀器
4.1 液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀。
4.2 分析天平：感量0.0001 g
4.3 分析天平：感量0.00001 g。
4.4 超聲波清洗儀。
4.5 離心機(jī)
4.6 渦旋混合儀 5 測定步驟
5.1 樣品處理
稱取樣品約1.0 g（精確至0.001 g），置于10 mL比色管中，加入1mL飽和氯化鈉溶液，渦旋30s后加入乙腈，定容至刻度，渦旋30 s，超聲提取30 min，渦旋1 min，4500 rpm離心5 min，取上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，濾液作為待測液備用。
5.2 液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用分析條件
5.2.1 色譜條件
色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱 (3.5 μm, 2.1*150mm)，螺內(nèi)酯和坎利酮兩個化合物色譜峰分離度要求大于1.5。
流動相：溶液A：0.2%甲酸水，溶液B：甲醇（含0.2%甲酸），梯度程序見表2
表2 流動相的梯度程序 時間（min） | 溶液A（%） | 溶液B（%） | 0 | 95 | 5 | 2 | 75 | 25 | 4 | 45 | 55 | 11 | 20 | 80 | 18 | 10 | 90 |
流速：0.3 mL/min；
柱溫：30 ℃；
進(jìn)樣量：5 μL。
5.2.2 質(zhì)譜參考條件
離子源：電噴霧離子源（ESI源）；
監(jiān)測模式：正離子監(jiān)測模式； 監(jiān)測離子對及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定見表3
噴霧壓力：40 psi；
干燥氣流速：8 L/min；
干燥氣溫度：325 ℃；
毛細(xì)管電壓：4000 V；
0 ～3.5 min：不進(jìn)入質(zhì)譜儀分析, 3.5 ～18 min：進(jìn)入質(zhì)譜儀分析。
表3 三重四極桿離子對及相關(guān)電壓參數(shù)設(shè)定表 編號 | 物質(zhì)名稱 | 母離子（m/z） | Frag.(V) | 子離子（m/z） | CE（V） | 1 | 米諾地爾 | 210．0 | 110 | 193.2 | 10 | 110 | 164.1* | 25 | 2 | 氫化可的松 | 363.1 | 125 | 327 | 10 | 125 | 121* | 25 | 3 | 螺內(nèi)酯 | 341.1 | 147 | 107.1* | 35 | 165 | 90.9 | 65 | 4 | 雌酮 | 271.2 | 105 | 253.1* | 5 | 105 | 132.8 | 22 | 5 | 坎利酮 | 341.1 | 147 | 107.1* | 35 | 165 | 90.9 | 65 | 6 | 醋酸曲安奈德 | 477.1 | 100 | 457.2* | 5 | 100 | 439.1 | 10 | 7 | 黃體酮 | 315.2 | 140 | 109 | 25 | 140 | 97* | 23 | *指定量離子對
5.3 定性判定
用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對樣品進(jìn)行定性判定，在相同試驗條件下，樣品中被測禁用物質(zhì)的質(zhì)量色譜峰保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中對應(yīng)物質(zhì)的質(zhì)量色譜峰保留時間一致；樣品色譜圖中所選擇的監(jiān)測離子對的相對豐度比與相當(dāng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子相對豐度比的偏差不超過表4規(guī)定范圍，則可以判斷樣品中存在對應(yīng)的禁用物質(zhì)。
表4 定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差
相對離子豐度（k） | k≥50% | 50 %> k ≥ 20 % | 20 %> k ≥ 10 % | k≤ 10 % | 允許的最大偏差 | ±20% | ±25% | ±30% | ±50% |
5.4 定量測定
在“5.2”項液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用分析條件下，用系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.6）分別進(jìn)樣，以禁用物質(zhì)的系列濃度為橫坐標(biāo)，禁用物質(zhì)的峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，建立溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性相關(guān)系數(shù)應(yīng) 大于0.99。取“5.1”項下處理得到的待測溶液進(jìn)樣5 μL，禁用物質(zhì)的峰面積代入溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算禁用物質(zhì)的質(zhì)量濃度，按“6 項計算”，計算樣品中禁用物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。
5.5 平行實驗
按以上步驟操作，對同一樣品獨立進(jìn)行測定獲得的兩次獨立測試結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的15%。
式中：w——化妝品中禁用物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，μg /g；
m ——樣品取樣量，g；
r ——代入回歸方程計算得到的待測樣液中禁用物質(zhì)的質(zhì)量濃度，ng/mL；
V——定容體積，mL；
D—— 稀釋倍數(shù)（不稀釋則為1）。
7 回收率和精密度
多家實驗室驗證的平均方法回收率為90.4%~113.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于8.6%。
8 色譜圖
色譜峰：1.米諾地爾，2.氫化可的松，3.螺內(nèi)酯，4.雌酮，5.坎利酮，6.醋酸曲安奈德，7.黃體酮
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