本指南旨在幫助北京市醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)管人員增強(qiáng)對(duì)無菌檢驗(yàn)相關(guān)知識(shí)的認(rèn)識(shí)，指導(dǎo)和規(guī)范全市醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)管人員對(duì)醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)無菌檢驗(yàn)過程控制水平的監(jiān)督檢查工作，同時(shí)，為醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)（以下簡稱生產(chǎn)企業(yè)）在無菌檢驗(yàn)的過程管理要求提供參考和依據(jù)。

　　當(dāng)國家相關(guān)法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)、檢查要求發(fā)生變化時(shí)，應(yīng)重新修訂本指南。

　　一、適用范圍

　　本指南適用于北京市藥品監(jiān)督管理局組織、實(shí)施的《醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)許可證》核發(fā)、變更、換證等現(xiàn)場檢查、醫(yī)療器械質(zhì)量管理體系考核、醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范檢查、醫(yī)療器械生產(chǎn)日常監(jiān)督等各項(xiàng)涉無菌檢驗(yàn)的檢查。

　　二、檢查內(nèi)容

　　檢查人員應(yīng)在充分了解生產(chǎn)企業(yè)無菌檢驗(yàn)活動(dòng)的情況下，對(duì)其無菌檢驗(yàn)過程的控制水平進(jìn)行客觀的檢查和評(píng)價(jià)。

　　一般情況下，檢查人員可按照以下順序開展檢查工作，并適時(shí)做好相關(guān)記錄：

　　1、了解產(chǎn)品特性及生產(chǎn)企業(yè)選擇的無菌檢驗(yàn)方法。常見的產(chǎn)品無菌檢查法包括直接接種法和薄膜過濾法。當(dāng)建立產(chǎn)品的無菌檢查方法時(shí)，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)進(jìn)行方法的驗(yàn)證，以證明所采用的方法能夠給出正確的結(jié)果。若該產(chǎn)品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)，檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)，應(yīng)按供試品無菌檢查的規(guī)定及有關(guān)要求進(jìn)行操作。對(duì)藥典規(guī)定的每一試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)也可與供試品的無菌檢查同時(shí)進(jìn)行。

　　2、了解檢驗(yàn)人員的專業(yè)背景、培訓(xùn)情況及工作經(jīng)歷?？赏ㄟ^查看學(xué)歷證書、培訓(xùn)證書或當(dāng)面詢問檢驗(yàn)人員的方式，檢查無菌檢驗(yàn)人員是否具備微生物專業(yè)知識(shí)，并經(jīng)過無菌技術(shù)的培訓(xùn)。

　　3、現(xiàn)場察看無菌實(shí)驗(yàn)室。無菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000 級(jí)下的局部潔凈度 100 級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)（如在萬級(jí)潔凈間內(nèi)配置超凈工作臺(tái)等）中進(jìn)行，其全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染。單向流空氣區(qū)、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期監(jiān)測。

　　4、現(xiàn)場察看無菌試驗(yàn)所需的設(shè)備和器具。其中，

　　主要設(shè)備包括：恒溫培養(yǎng)箱（真菌、細(xì)菌）、恒溫水浴箱、壓力蒸汽滅菌器、電熱干燥箱、電子天平、光學(xué)顯微鏡、集菌儀、過濾裝置（無油真空泵、濾杯、濾頭、濾瓶、微孔濾膜、夾子）等；（從試驗(yàn)安全性考慮，建議陽性對(duì)照試驗(yàn)使用生物安全柜）

　　主要器具有：試管及試管架、酒精燈、75％乙醇棉、滅菌刻度吸管(1ml)、滅菌平皿（9cm）、錐形瓶、三角燒瓶、滅菌剪刀、鑷子等。

　　生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)采用可靠方法對(duì)與供試液接觸的所有器具滅菌，通常置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)121℃30分鐘，或置電熱干燥箱內(nèi)160℃2小時(shí)。器具滅菌后必須做好標(biāo)識(shí)，標(biāo)明滅菌的時(shí)間和使用有效期。器皿在滅菌后，最多1周即用完。檢查時(shí)還應(yīng)注意清點(diǎn)培養(yǎng)皿的個(gè)數(shù)，與試驗(yàn)記錄中反映的培養(yǎng)基個(gè)數(shù)是否一致。

　　5、對(duì)照生產(chǎn)企業(yè)有關(guān)無菌試驗(yàn)的管理制度、操作規(guī)程等相關(guān)技術(shù)文件，要求檢驗(yàn)人員當(dāng)場操作或口述無菌檢驗(yàn)的過程。

　?。?）培養(yǎng)基制備

　　生產(chǎn)企業(yè)可按藥典中的處方制備培養(yǎng)基，亦可使用按該處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。配制后應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在2℃～25℃、避光的環(huán)境，若保存于非密閉容器中，一般在3周內(nèi)使用；若保存于密閉容器中，一般可在1年內(nèi)使用。

　　無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基等應(yīng)符合培養(yǎng)基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時(shí)進(jìn)行。

　?。?）供試品的無菌檢查

　　無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜過濾法。供試品無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗(yàn)條件應(yīng)與驗(yàn)證的方法相同。無菌試驗(yàn)過程中，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應(yīng)證明其有效性，且對(duì)微生物無毒性。

　　無菌操作時(shí)，對(duì)供試品容器表面應(yīng)用適宜的消毒液進(jìn)行徹底消毒，如果供試品容器內(nèi)有一定的真空度，可用適宜的無菌器材（如帶有除菌過濾器的針頭）向容器內(nèi)導(dǎo)入無菌空氣，再按無菌操作起開容器取出內(nèi)容物。

　　（3）培養(yǎng)及觀察

　　含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天。培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長。如在加入供試品后、或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中，細(xì)菌培養(yǎng)2天、真菌培養(yǎng)3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。

　　在觀察試驗(yàn)結(jié)果的過程中，還應(yīng)考慮假陰性的影響。其中影響假陰性發(fā)生的因素有：培養(yǎng)條件不能支持微生物的生長（促生長試驗(yàn)）；在無菌試驗(yàn)中，產(chǎn)品中釋放出了殺菌或微生物電解的物質(zhì)（消除抑菌物質(zhì)）；從滅菌處理到培養(yǎng)有一定的時(shí)間間隔（確定滅菌后產(chǎn)品的儲(chǔ)存條件及儲(chǔ)存時(shí)間）。

　?。?）結(jié)果判斷

　　生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷：

　?、偃艄┰嚻饭芫吻?，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定；②若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗(yàn)結(jié)果無效，即生長的微生物非供試品所含。陽性對(duì)照管應(yīng)生長良好，陰性對(duì)照管不得有菌生長，否則試驗(yàn)無效。

　　當(dāng)符合下列至少一個(gè)條件時(shí)，方可判試驗(yàn)結(jié)果無效：①無菌檢查試驗(yàn)所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求；②回顧無菌試驗(yàn)過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素；③供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無菌試驗(yàn)中所使用的物品和（或）無菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。

試驗(yàn)若經(jīng)確認(rèn)無效，應(yīng)重試。重試時(shí)，重新取同量供試品，依法重試，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。

　　6、查閱試驗(yàn)記錄。完整的試驗(yàn)記錄應(yīng)明確包含下列幾類信息：

　?。?）樣品記錄，至少應(yīng)包括：取樣日期、樣品名稱、樣品規(guī)格、樣品批號(hào)、取樣地點(diǎn)、取樣方式、取樣人、原始試驗(yàn)記錄序號(hào)。

　　（2）滅菌物品制作記錄

　?、倥囵B(yǎng)基：培養(yǎng)基名稱、培養(yǎng)基批號(hào)、培養(yǎng)基用量（g）、蒸餾水用量（ml）、培養(yǎng)基分裝數(shù)量、滅菌日期、滅菌的實(shí)際溫度和壓力、滅菌時(shí)間、制作人、培養(yǎng)基存放地點(diǎn)和有效期等。

　?、谄骶撸浩骶呙Q、器具數(shù)量、滅菌日期、滅菌的實(shí)際溫度和壓力、滅菌時(shí)間、制作人、器具存放地點(diǎn)、有效期等。

　　（3）原始試驗(yàn)記錄，至少應(yīng)包括：記錄名稱、記錄序號(hào)、樣品名稱、樣品唯一性標(biāo)識(shí)（例如：樣品號(hào)）、樣品規(guī)格、樣品批號(hào)、滅菌批號(hào)、樣品數(shù)量、取樣日期、檢驗(yàn)日期、檢驗(yàn)依據(jù)、主要試驗(yàn)設(shè)備及器具、試驗(yàn)方法、試驗(yàn)環(huán)境條件、試驗(yàn)結(jié)果（每日觀察的結(jié)果）、試驗(yàn)結(jié)論、檢測人、復(fù)核人等。

　?。?）廢棄物處理記錄，至少應(yīng)包括：廢棄物形態(tài)（固體、液體）、廢棄物數(shù)量、滅菌時(shí)間和壓力、經(jīng)辦人、處理日期等。

　　三、其它應(yīng)注意的問題

　　1、生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)確保樣品具有代表性：試驗(yàn)樣品應(yīng)從常規(guī)產(chǎn)品中能夠代表加工過程和條件的批中選擇。選擇樣品是隨機(jī)的。試驗(yàn)樣品的選擇和處理技術(shù)應(yīng)明確，以免對(duì)樣品上所含的微生物的數(shù)量和種類造成污染和改變。試驗(yàn)樣品可以選擇制造過程中的不合格產(chǎn)品，它們應(yīng)該代表這個(gè)生產(chǎn)批的加工程序和條件。用于試驗(yàn)的不合格產(chǎn)品應(yīng)不會(huì)影響無菌測試的有效性。

　　2、生產(chǎn)企業(yè)對(duì)于供試品的選取、轉(zhuǎn)移過程要采取防止污染措施，確保試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。選取制作供試品的試驗(yàn)樣品時(shí)，樣品包裝須完好無損，尤其是只有一層包裝的樣品。進(jìn)入無菌檢驗(yàn)室的樣品若有兩層（或兩層以上）包裝的，需將外包裝在傳遞窗（或緩沖間）拆除后，傳入實(shí)驗(yàn)室。

　　3、無菌檢驗(yàn)中接觸供試品的試驗(yàn)用具溫度不能過高以防可能存在的菌被燙死。對(duì)不同種類和不同批次的產(chǎn)品，在拆包裝及夾取樣品時(shí)，應(yīng)更換試驗(yàn)用具（如：剪刀、鑷子）。

　　4、進(jìn)入無菌操作室的所有培養(yǎng)基、供試品等的外表都應(yīng)采用適用的方法進(jìn)行消毒處理（如：紫外燈照射不少于30分鐘），以避免將外包裝污染的微生物帶入無菌檢驗(yàn)室。出具試驗(yàn)結(jié)果后，所有培養(yǎng)物須經(jīng)121℃高壓滅菌30分鐘的處理。

　　5、由于無菌檢驗(yàn)時(shí)間跨度較長，因此過程的記錄應(yīng)能夠完整體現(xiàn)試驗(yàn)的全過程，對(duì)于在試驗(yàn)過程中出現(xiàn)的各種情況，均應(yīng)在記錄中客觀反映。
　　參考資料一：

　　常見的名詞解釋

　　1、滅菌：殺滅或除去特定環(huán)境或物品中一切微生物的過程。目前國際上規(guī)定，滅菌過程必須使滅菌物品污染的微生物存活率減少到10^-6及以下。

　　2、微生物：在顯微鏡下才能看到的微小實(shí)體，包括細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物和病毒。

　　3、無菌技術(shù)：是指在微生物試驗(yàn)工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施，其中包括無菌環(huán)境設(shè)施、無菌試驗(yàn)器材以及無菌操作。

　　4、無菌操作：是指在無菌環(huán)境條件下，在對(duì)無菌制品或無菌器械進(jìn)行檢驗(yàn)的過程中，能防止微生物污染與干擾的一種常規(guī)操作方法。

　　5、培養(yǎng)條件：用于促進(jìn)微生物發(fā)育、生長和繁殖的生長培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式的組合。

　　6、需氧菌：在代謝中，有氧條件下才能生存的微生物。

　　7、厭氧菌：在代謝中，沒有氧的條件下才能生存的微生物。

　　8、抑細(xì)菌/抑霉菌試驗(yàn)：用選定的微生物來演示某些物質(zhì)的存在能夠抑制這些微生物的繁殖。

　　9、促生長試驗(yàn)：用于證明生長培養(yǎng)基能夠支持微生物生長的技術(shù)操作。

　　10、假陰性：實(shí)際陽性的無菌試驗(yàn)結(jié)果被變成了陰性。

　　11、假陽性：實(shí)際陰性的無菌試驗(yàn)結(jié)果被變成了陽性。

　　12、生物指示物：對(duì)特定滅菌工藝有確定的抗力，可供使用的微生物檢驗(yàn)器材。

　　13、化學(xué)指示物：根據(jù)暴露于某種滅菌工藝所產(chǎn)生的化學(xué)或物理變化，在一個(gè)或多個(gè)預(yù)定工藝參數(shù)上顯示變化的指示器材。

　　14、無菌保證水平（SAL）:滅菌后產(chǎn)品上存在單個(gè)活微生物的概率。

　　參考資料二：

　　無菌室空氣中菌落數(shù)的檢查

　　無菌室在消毒處理完畢后，應(yīng)檢查空氣中的菌落數(shù)。方法如下：取直徑約90mm培養(yǎng)皿，無菌操作注入融化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約20mL，在30℃～35℃培養(yǎng)48小時(shí)證明無菌后，取3只培養(yǎng)皿在無菌室操作臺(tái)或超凈工作臺(tái)平均位置打開上蓋，暴露30分鐘后蓋好，置30℃～35℃培養(yǎng)48小時(shí)后取出檢查，3只雙碟上生長的菌落數(shù)平均不得超過1個(gè)。無菌試驗(yàn)過程中應(yīng)檢查空氣中的菌落數(shù)，方法同上。在試驗(yàn)開始進(jìn)行時(shí)打開平皿蓋，至試驗(yàn)結(jié)束蓋好照上法培養(yǎng)，應(yīng)符合上述要求。

　　參考資料三：

　　供試品數(shù)量的選擇

　　檢驗(yàn)數(shù)量是指一次試驗(yàn)所用供試品最小包裝容器的數(shù)量。除另有規(guī)定外，出廠產(chǎn)品按藥典附錄ⅩⅢ B中表1規(guī)定；上市產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)按表2、表3規(guī)定。表1、表2、表3中最少檢驗(yàn)數(shù)量不包括陽性對(duì)照試驗(yàn)的供試品用量。一般情況下，供試品無菌檢查若采用薄膜過濾法，應(yīng)增加1/2的最小檢驗(yàn)數(shù)量作陽性對(duì)照用；若采用直接接種法，應(yīng)增加供試品1 支（或瓶）作陽性對(duì)照用。執(zhí)行GB/T14233.2的供試品數(shù)量應(yīng)滿足同一批號(hào)3～11個(gè)單位供試品。

　　檢驗(yàn)量是指一次試驗(yàn)所用的供試品總量（g或ml）。除另有規(guī)定外，每份培養(yǎng)基接種的供試品量按表2、表3規(guī)定。若每支（瓶）供試品的裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則應(yīng)分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。采用薄膜過濾法時(shí)，檢驗(yàn)量應(yīng)不少于直接接種法的總接種量，只要供試品特性允許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部內(nèi)容物過濾。

表1 批出廠產(chǎn)品最少量檢驗(yàn)數(shù)量

　　注:若每個(gè)容器中的裝量不足接種兩種培養(yǎng)基,那么表中的檢驗(yàn)數(shù)量應(yīng)加倍

表2 上市抽驗(yàn)樣品(液體制劑)的最少檢驗(yàn)量

①每種培養(yǎng)基各接種10支供試品.

表3 上市抽驗(yàn)樣品(固體制劑)的最少檢驗(yàn)量

　?、倜糠N培養(yǎng)基各接種10支供試品

　?、谕把b固體原料的最少檢驗(yàn)數(shù)量為4個(gè)包裝

　　參考資料四：

　　培養(yǎng)基的制備

　　培養(yǎng)應(yīng)注意培養(yǎng)條件：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 30～35℃14天；改良馬丁培養(yǎng)基 23～28℃14天。選擇培養(yǎng)條件需考慮的因素：產(chǎn)品的性質(zhì)、制造方法、潛在的微生物污染來源、可能遇到的微生物種類。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基必須在煮沸后，再進(jìn)行分裝、滅菌。

　　1、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基

　　酪胨 (胰酶水解) 15.0g、酵母浸出粉 5.0g、葡萄糖 5.0g、氯化鈉 2.5g、L-胱氨酸 0.5g、新配制的0.1%刃天青溶液 1.0 ml、硫乙醇酸鈉 0.5g(或硫乙醇酸 0.3ml)、瓊脂 0.75g、水 1000 ml

　　除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié) pH 為弱堿性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調(diào)節(jié) pH 值使滅菌后為 7.1±0.2。分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度的 1/2。滅菌。在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的 1/5 ，否則，須經(jīng) 100 ℃水浴加熱至粉紅色消失（不超過 20 分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次，并防止被污染。

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置 30℃～35℃培養(yǎng)。

　　2、改良馬丁培養(yǎng)基

　　胨 5.0g、磷酸氫二鉀 1.0g、酵母浸出粉 2.0g、硫酸鎂 0.5g、葡萄糖 20.0g、水 1000 ml

　除葡萄糖外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值約為6.8，煮沸，加入葡萄糖溶解后，搖勻，濾清，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為6.4±0.2，分裝，滅菌。

改良馬丁培養(yǎng)基置 23℃～28℃培養(yǎng)。

　　3、選擇性培養(yǎng)基

　　按上述硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基的處方及制法，在培養(yǎng)基滅菌或使用前加入適宜的中和劑、滅活劑或表面活性劑，其用量同驗(yàn)證試驗(yàn)。

　　4、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基

　　胨 10.0g、氯化鈉 5.0g、牛肉浸出粉 3.0g、水 1000 ml

　　取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié) pH 為弱堿性，煮沸，濾清，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為 7.2±0.2，分裝，滅菌。

　　5、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

　　按上述營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的處方及制法，加入14.0g瓊脂，調(diào)節(jié)pH 值使滅菌后為7.2±0.2，分裝，滅菌。

　　6、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基

　　按改良馬丁培養(yǎng)基的處方及制法，加入14.0g 瓊脂，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為6.4±0.2，分裝，滅菌。
　　參考資料五：

　　培養(yǎng)基的適用性檢查

　　1、無菌性檢查：每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5支（瓶），培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長。

　　2、靈敏度檢查

　　菌種：培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），試驗(yàn)用菌種應(yīng)采用適宜的菌種保存技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。

　　金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕

　　銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B) 10 104〕

　　枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕

　　生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕

　　白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕

　　黑曲霉(Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98 003〕

　　3、菌液制備

　　接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30℃～35℃培養(yǎng)18小時(shí)～24小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，23～28℃培養(yǎng)24～48小時(shí)，上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml 含菌數(shù)小于100cfu（菌落形成單位）的菌懸液。

　　接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23～28℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml 含孢子數(shù)小于100cfu的孢子懸液。

　　菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在2～8℃可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2～8℃，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。

　　4、培養(yǎng)基接種

　　取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9支，分別接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng)3天；取每管裝量為9ml的改良馬丁培養(yǎng)基5支,分別接種小于100cfu 的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng)5天。逐日觀察結(jié)果。

　　5、結(jié)果判定

　　空白對(duì)照管應(yīng)無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。

　　參考資料六：

　　方法驗(yàn)證試驗(yàn)

　　1、菌種及菌液制備

　　除大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 4 4102〕外，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培養(yǎng)基靈敏度檢查。大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。

　　2、薄膜過濾法

　　取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗(yàn)菌，過濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗(yàn)菌，作為對(duì)照。置規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5天，各試驗(yàn)菌同法操作。

　　3、直接接種法

　　取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8管，分別接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2管，取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的改良馬丁培養(yǎng)基4管，分別接入小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定量的供試品量，另1管作為對(duì)照，按置規(guī)定的溫度培養(yǎng)3～5天。

　　4、結(jié)果判斷

　　與對(duì)照管比較，如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)，照此檢查方法和檢查條件進(jìn)行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中的試驗(yàn)菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用，可采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)。

　　參考資料七：

　　供試品處理及接種培養(yǎng)基

　　直接接種法：每個(gè)供試品按規(guī)定量分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的容器中。除另有規(guī)定外，每個(gè)容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，同時(shí)，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml，改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。

　　薄膜過濾法：將供試液混勻，過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用適量的沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)不得少于三次。沖洗后，如用封閉式薄膜過濾器，分別將100ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基加入相應(yīng)的濾筒內(nèi)。如采用一般薄膜過濾器，取出濾膜，將其剪成 3等份，分別置于含50ml 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基的容器中，其中一份做陽性對(duì)照用。

　　薄膜過濾法應(yīng)優(yōu)先采用封閉式薄膜過濾器，也可使用一般薄膜過濾器。無菌檢查用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45μm。直徑約為50mm。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)?？股毓┰嚻窇?yīng)選擇低吸附的濾器及濾膜。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。

　　參考資料八：

　　對(duì)照試驗(yàn)

　　1、陽性對(duì)照：一般情況下，供試品無菌檢查若采用薄膜過濾法，應(yīng)增加1/2的最小檢驗(yàn)數(shù)量作陽性對(duì)照用；若采用直接接種法，應(yīng)增加供試品無菌檢查時(shí)每個(gè)培養(yǎng)基容器接種的樣品量作陽性對(duì)照用。

　　陽性對(duì)照應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽性對(duì)照菌：無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對(duì)照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對(duì)照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對(duì)照菌；抗真菌的供試品，以白色念珠菌為對(duì)照菌。陽性對(duì)照試驗(yàn)的菌液制備同方法驗(yàn)證試驗(yàn)，加菌量小于100cfu，供試品用量同供試品無菌檢查每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽性對(duì)照管培養(yǎng)48～72小時(shí)應(yīng)生長良好。

　　2、陰性對(duì)照：供試品無菌檢查時(shí)，應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長。

　　3、稀釋液、沖洗液及其制備方法

　　稀釋液、沖洗液配制后應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。

　?。?）0.1%蛋白胨水溶液 取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微溫溶解，濾清，調(diào)節(jié)pH值至7.1±0.2，分裝，滅菌。

　　（2）pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液取磷酸二氫鉀3.56g，磷酸氫二鈉7.23g，氯化鈉4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000ml，微溫溶解，濾清，分裝，滅菌。

　?。?）根據(jù)供試品的特性，可選用其他經(jīng)驗(yàn)證過的適宜的溶液作為稀釋液、沖洗液。

　　如需要，可在上述稀釋液或沖洗液的滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑等。

　　參考資料九：

　　參考標(biāo)準(zhǔn)

　　——《中華人民共和國藥典》

　　——GB/T14233.2《醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法 第2部分生物學(xué)試驗(yàn)方法》

　　——GB19489《實(shí)驗(yàn)室 生物安全通用要求》

　　——GB50346《生物安全實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范》

　　——GB/T16292～16294《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》

　　——ISO11737-2《醫(yī)療器械的滅菌 微生物方法 第2部分：滅菌過程定義、驗(yàn)證和保持中的無菌檢測》