腫瘤個體化用藥相關(guān)基因突變檢測試劑
技術(shù)審查指導(dǎo)原則（征求意見稿）
本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對腫瘤個體化用藥相關(guān)基因突變檢測試劑注冊申報資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門對注冊申報資料的技術(shù)審評提供參考。
本指導(dǎo)原則是針對腫瘤個體化用藥相關(guān)基因突變檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細(xì)化。
本指導(dǎo)原則是對申請人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要詳細(xì)闡明理由，并對其科學(xué)合理性進行驗證，提供詳細(xì)的研究資料和驗證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。
本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。
本文所述腫瘤個體化用藥相關(guān)基因突變檢測試劑是指利用熒光探針聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）方法，以個體化用藥相關(guān)的腫瘤突變基因為檢測目標(biāo)，對人體樣本（包括組織、體液等）提取的核酸組分中的目標(biāo)序列進行體外檢測的試劑。
本文所指基因突變的類型包括置換、插入、缺失、基因重排、拷貝數(shù)異常及RNA表達(dá)異常等廣義的基因突變。
本文所涉及試劑的方法學(xué)不包括熒光原位雜交（Fluorescence in situ Hybridization，F(xiàn)ISH）、核酸序列測定、染色體核型分析及免疫組化技術(shù)等用于腫瘤個體化用藥指導(dǎo)的其他方法學(xué)；本文提出的相關(guān)要求亦不完全適用于PCR熔解曲線、Luminex平臺或核酸檢測芯片等其他分子生物學(xué)技術(shù)，但有利之處可以參考執(zhí)行。本指導(dǎo)原則適用于進行首次注冊申報和相關(guān)許可事項變更的產(chǎn)品。
綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、研究結(jié)果的總結(jié)評價以及同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容，其中同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從方法學(xué)及不同腫瘤突變類型檢出能力等方面寫明擬申報產(chǎn)品與目前市場上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。若尚無同品種批準(zhǔn)上市，則應(yīng)詳細(xì)論述作為檢測靶標(biāo)的突變基因與個體化用藥的相關(guān)性，說明理論依據(jù)。
提交的資料應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》（國食藥監(jiān)械〔2007〕229號）（以下簡稱《辦法》）和《體外診斷試劑注冊申報資料基本要求》（國食藥監(jiān)械〔2007〕609號）的相關(guān)要求。
說明書承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、標(biāo)本采集及處理、實驗方法、檢測結(jié)果解釋以及注意事項等重要信息，是指導(dǎo)實驗室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對檢驗結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)，因此，產(chǎn)品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產(chǎn)品說明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，境外試劑的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說明書的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請人提交的注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)以規(guī)范格式對此內(nèi)容進行標(biāo)注，并單獨列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。
結(jié)合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，下面對腫瘤個體化用藥相關(guān)基因突變檢測試劑說明書的重點內(nèi)容進行詳細(xì)說明，以指導(dǎo)注冊申報人員更合理地完成說明書編制。
1. 【預(yù)期用途】
應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：
（1） 臨床背景的介紹，包括相關(guān)適用人群特征、腫瘤的組織類型、適用的樣本類型、待測靶基因序列的特征及選擇依據(jù)，靶基因及其表達(dá)蛋白在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中可能起到的作用，相關(guān)藥物及其作用機理，以及藥物與待測突變位點可能存在的關(guān)系等。如無合理的臨床驗證，不建議在此涉及具體藥物產(chǎn)品（商品）名稱、生產(chǎn)企業(yè)等信息；若有相關(guān)臨床驗證，可在此明確具體藥物，但需在說明書中對相關(guān)的臨床研究情況進行簡介。
（2） 試劑盒用于特定腫瘤患者人群，通過檢測人體樣本提取的核酸組分中是否存在靶基因突變，對臨床上特定腫瘤患者的個體化用藥提供參考意見。腫瘤的類別及適用樣本類型應(yīng)結(jié)合實際的臨床研究完成情況進行確認(rèn)。
（3） 明確說明該試劑盒僅用于對特定腫瘤患者靶基因序列的檢測，其檢測結(jié)果僅供臨床參考，不應(yīng)作為患者個體化治療的唯一依據(jù)，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情、藥物適應(yīng)癥、治療反應(yīng)及其它實驗室檢測指標(biāo)等因素對檢測結(jié)果進行綜合判斷。
2. 【檢驗原理】
（1） 對試劑盒檢測能夠覆蓋的所有突變位點或突變類型進行詳細(xì)描述（靶序列長度、基因座位、突變類型及相關(guān)特征等），對引物及探針設(shè)計、不同樣品反應(yīng)管組合、對照品設(shè)置及熒光信號檢測原理等進行逐項介紹。
（2） 核酸提取方法、原理等。
（3） 試劑盒技術(shù)原理的詳細(xì)介紹，建議結(jié)合適當(dāng)圖示進行說明。如反應(yīng)體系中添加了相關(guān)的防污染組分（如UDG酶），也應(yīng)對其作用機理作適當(dāng)介紹。
3. 【主要組成成份】
（1） 詳細(xì)說明試劑盒內(nèi)各組分的名稱、數(shù)量、內(nèi)容物、比例或濃度、穩(wěn)定性等信息，陰性/陽性對照品（或質(zhì)控品）可能含有生物源性物質(zhì)的組分，應(yīng)說明其生物學(xué)來源、活性及其他特性；說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。
（2） 試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組分，企業(yè)應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的名稱、注冊證號（如有）及其他必要的信息。
（3） 如果試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分，則應(yīng)在此注明經(jīng)驗證后推薦配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱以及該產(chǎn)品的醫(yī)療器械注冊證號等詳細(xì)信息。
4. 【儲存條件及有效期】
試劑盒的效期（實時）穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等。
5. 【適用儀器】
所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。
6. 【樣本要求】
重點明確以下內(nèi)容：
（1） 對適用的樣本類型作詳細(xì)介紹，包括樣本來源及取材要求、樣本處理方式（如組織樣本的固定及包埋方式）、腫瘤細(xì)胞比例等。
樣本的取材及處理方式等若有通用的技術(shù)規(guī)范或指南，則應(yīng)遵循，并在此處引用。
（2） 樣本處理及保存：核酸提取前樣本的預(yù)處理、保存條件及期限（短期、長期）、運輸條件等。
（3） 在提取過程結(jié)束后，立即采用適當(dāng)方法（如分光光度計法）對提取后的核酸儲備液進行濃度確定，并依據(jù)性能驗證結(jié)果在此給出用于擴增試驗的核酸濃度要求。舉例：擴增反應(yīng)終體系中需要50ng的DNA量，而在終體系中需加入25μl的DNA儲備液，則在DNA提取完成后應(yīng)將DNA儲備液的濃度調(diào)整至2ng/μl的濃度。
注：基于試劑盒分析靈敏度的考慮，應(yīng)對提取后的核酸儲備液的核酸濃度設(shè)定低限要求，如提取后的核酸儲備液濃度低于其低限要求，應(yīng)擴大樣本量重新進行核酸的提取。
（4） 操作過程中各種制備液的穩(wěn)定性要求，如各類混合液（Mix）、DNA/RNA儲備液、反應(yīng)終體系等(常溫/冷藏/冷凍/凍融次數(shù)限制等）。
7. 【檢驗方法】
詳細(xì)說明實驗操作的各個步驟，包括：
（1） 實驗條件：實驗室分區(qū)、實驗環(huán)境的溫度、濕度、空調(diào)氣流方向控制等注意事項。
（2） 試劑配制方法、注意事項。
（3） 詳述核酸提取的條件、步驟及注意事項。對照品（質(zhì)控品）應(yīng)參與樣本核酸的平行提取，以對核酸提取環(huán)節(jié)進行合理的質(zhì)量控制。
（4） 擴增反應(yīng)前準(zhǔn)備：各組分加樣體積、順序、相關(guān)注意事項等。
（5） 逆轉(zhuǎn)錄過程（如涉及）的溫度和時間設(shè)置、PCR各階段的溫度、時間設(shè)置、循環(huán)數(shù)設(shè)置及相關(guān)注意事項。
（6） 儀器設(shè)置：特殊參數(shù)，待測基因、內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)的熒光通道選擇等。
8. 【參考值（參考范圍）】
參考值（參考范圍）的描述包括基線的確定方法和循環(huán)閾值（Ct值）的要求。除Ct值要求外，建議結(jié)合是否出現(xiàn)典型S形曲線對結(jié)果進行判斷。
9. 【檢驗結(jié)果的解釋】
結(jié)合陽性對照、陰性對照以及樣本管中靶基因和內(nèi)標(biāo)的檢測結(jié)果（Ct值），對所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解釋進行詳述。如存在檢測灰區(qū)，應(yīng)對灰區(qū)結(jié)果的處理方式一并詳述。
10. 【檢驗方法的局限性】
（1） 本試劑盒的檢測結(jié)果僅供臨床參考，對患者個性化治療的選擇應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實驗室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。
（2） 陰性結(jié)果不能完全排除靶基因突變的存在，樣本中腫瘤細(xì)胞過少、過度降解或擴增反應(yīng)體系中靶基因濃度低于檢測限亦可造成陰性結(jié)果。
（3） 不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運及處理、以及不當(dāng)?shù)脑囼灢僮骱蛯嶒灜h(huán)境均有可能導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果。
（4） 明確該檢測僅限于規(guī)定的樣本類型及檢測系統(tǒng)（包括適用機型、核酸提取試劑、檢測方法等）。
11. 【產(chǎn)品性能指標(biāo)】
詳述以下性能指標(biāo)：
（1） 對相應(yīng)國家參考品（如有）檢測的符合情況。
（2） 最低檢測限（分析靈敏度）：試劑盒能夠覆蓋的所有突變靶序列的最低檢出濃度，重點考慮原始模板中突變基因的百分率和擴增終體系中核酸濃度兩個因素對分析靈敏度的影響。簡單介紹最低檢測限的確定方法以及對最低檢測限驗證所采用的靶序列的信息。
（3） 企業(yè)內(nèi)部陽性/陰性參考品符合率，陽性/陰性參考品的組成、來源、濃度梯度設(shè)置以及評價標(biāo)準(zhǔn)等信息。
（4） 精密度：精密度參考品的組成、來源、濃度梯度要求及評價標(biāo)準(zhǔn)。
（5） 分析特異性
①野生型驗證：應(yīng)采用不同濃度的野生型核酸樣本進行驗證，其結(jié)果應(yīng)均為陰性。
②試劑盒內(nèi)交叉反應(yīng)：如考核試劑包括對多個突變位點的檢測，則應(yīng)對該試劑盒覆蓋范圍內(nèi)的所有突變類型間進行交叉反應(yīng)驗證。
③序列相近或具有一定同源性的其他較常見突變或野生型基因序列間的交叉反應(yīng)驗證。
④潛在干擾物質(zhì)驗證。
如果經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn)某些序列與靶序列的交叉反應(yīng)出現(xiàn)陽性結(jié)果，則應(yīng)該對存在交叉反應(yīng)的核酸序列及濃度進行驗證并在產(chǎn)品說明書中表明這種假陽性發(fā)生的可能，做出相關(guān)的提示。
（6） 對比試驗研究（如有）：簡要介紹參比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計學(xué)方法及統(tǒng)計分析結(jié)果。
12. 【注意事項】
應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：
（1） 如該產(chǎn)品含有人源或動物源性物質(zhì)，應(yīng)給出具有潛在感染性的警告。
（2） 臨床實驗室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號）等有關(guān)分子生物學(xué)實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。
擬定產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》和《體外診斷試劑注冊申報資料基本要求》的相關(guān)規(guī)定。另外，對于國產(chǎn)試劑，應(yīng)參考《中國生物制品規(guī)程》（2000年版），將申報產(chǎn)品的主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品檢定等內(nèi)容作為附錄附于標(biāo)準(zhǔn)正文后，并在正文的“產(chǎn)品分類”項中引出該附錄內(nèi)容。附錄中應(yīng)將待測靶基因的基因位點、引物/探針設(shè)計及來源、參考品設(shè)置、來源及驗證情況、各種酶的來源、特性及驗證等重點內(nèi)容予以明確。
腫瘤個體化用藥相關(guān)基因突變檢測試劑的注冊檢測應(yīng)主要包括以下性能指標(biāo)：物理性狀、試劑盒內(nèi)陰/陽性對照品（質(zhì)控品）的Ct值要求（包括內(nèi)標(biāo)）、陰/陽性參考品符合率、精密度、最低檢測限（分析靈敏度）等。陽性參考品主要考察對試劑盒覆蓋范圍內(nèi)不同突變基因的檢測符合性，陰性參考品則重點對申報試劑的分析特異性進行驗證。
如果申報試劑已有相應(yīng)的國家/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布，則企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求不得低于國家/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求。
根據(jù)《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》的要求，首次申請注冊的第三類產(chǎn)品應(yīng)該在國家食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)可的、具有相應(yīng)承檢范圍的醫(yī)療器械檢測機構(gòu)進行連續(xù)3個生產(chǎn)批次樣品的注冊檢測。對于已經(jīng)有國家標(biāo)準(zhǔn)品的檢測項目，在注冊檢測時應(yīng)采用相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)品進行,對于目前尚無國家標(biāo)準(zhǔn)品的項目，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)建立自己的參考品體系并提供相應(yīng)的內(nèi)部參考品。
應(yīng)提供主要原材料如引物、探針、企業(yè)參考品的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量分析和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料。若主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對穩(wěn)定，并提交工藝驗證報告；如主要原材料購自其他供貨商，應(yīng)提供的資料包括：對物料供應(yīng)商審核的相關(guān)資料、供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。
1. 核酸分離/純化組分（如有）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗證資料。
2. PCR和/或RT-PCR組分的主要原料（包括引物、探針、各種酶及其他主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及實驗研究資料，主要包括以下內(nèi)容：
（1） 脫氧三磷酸核苷（dNTP）
核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，對純度、濃度、保存穩(wěn)定性等的驗證資料。
（2） 引物
由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或其他適宜方法純化。需提供對分子量、純度、穩(wěn)定性、功能性實驗等的驗證資料。如為外購，應(yīng)提供合成機構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如PAGE電泳結(jié)果或高效液相色譜法（HPLC）分析圖譜。
（3） 探針
特定的帶有示蹤物（標(biāo)記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或其他適宜方法純化，在5-端(和/或3-端)進行標(biāo)記，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化，純度應(yīng)達(dá)到HPLC純。應(yīng)提供合成機構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如HPLC分析圖譜，應(yīng)對探針的分子量及標(biāo)記的熒光素進行核實，并進行功能性試驗驗證。
（4） 酶
DNA聚合酶，應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性，如：94℃保溫1小時后仍保持50%活性；尿嘧啶糖基化酶（UNG），具有尿嘧啶糖基化活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性，應(yīng)對酶活性有合理驗證；逆轉(zhuǎn)錄酶，具逆轉(zhuǎn)錄酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性。
3. 核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無DNase和RNase污染。
4. 企業(yè)內(nèi)部參考品：應(yīng)詳細(xì)說明有關(guān)企業(yè)內(nèi)部參考品的原料選擇、制備、定值過程等試驗資料。具體要求如下：
（1） 陽性參考品
試劑盒（分型或不分型）所能覆蓋的所有突變位點均應(yīng)設(shè)置相應(yīng)的陽性參考品，每個突變位點設(shè)置至少三個突變百分率梯度，其中需包括至少一份弱陽性參考品。陽性參考品的突變形式及濃度需經(jīng)過金標(biāo)準(zhǔn)方法或已上市同類分型試劑的確認(rèn)。
如申報試劑用于DNA樣本的檢測，則陽性參考品可以采用臨床樣本提取的DNA儲備液或相應(yīng)質(zhì)粒作為原料。如申報試劑用于RNA樣本的檢測，陽性參考品可以采用臨床樣本提取的RNA儲備液、相應(yīng)RNA凍干粉或假病毒的形式；如覆蓋突變位點過多，可以對其中部分突變位點采用質(zhì)粒的形式，但不能全部采用質(zhì)粒，需包括部分突變類型（申請人自行確定其代表性）RNA為模板的陽性參考品以對逆轉(zhuǎn)錄（RT）過程進行監(jiān)控。
（2） 陰性參考品
可采用源于健康人、經(jīng)確認(rèn)無相應(yīng)靶突變序列的野生型DNA儲存液。
（3） 靈敏度參考品（檢測限參考品）
靈敏度參考品的原料要求參考陽性參考品，需包括所有的突變類型，可以僅設(shè)置分析靈敏度水平的一個濃度即可。
（4） 精密度參考品
精密度參考品原料要求參考陽性參考品，需包括陰性、弱陽性、中或強陽性三個濃度水平的精密度驗證，陰性和中/強陽性精密度參考品可不必包括所有突變類型，以常見突變類型（申請人自行確定其代表性）為主，但弱陽性參考品需包括所有突變位點。
5. 試劑盒內(nèi)對照品（質(zhì)控品）
試劑盒的質(zhì)控體系通過設(shè)置各種試劑盒對照品來實現(xiàn)，質(zhì)控體系需考慮對樣本核酸提取、配液及加樣、試劑及儀器性能、擴增反應(yīng)抑制物（管內(nèi)抑制）、交叉污染、靶核酸降解等因素可能造成的假陰性或假陽性結(jié)果進行合理的質(zhì)量控制。所有陽性對照品的核酸性質(zhì)應(yīng)與待測樣本的靶核酸性質(zhì)一致，如同為DNA或RNA。申報資料應(yīng)對試劑盒對照品有關(guān)原料選擇、制備、定值過程等試驗資料詳細(xì)說明。申請人應(yīng)視申報產(chǎn)品具體情況設(shè)置合理的試劑盒對照品（質(zhì)控品），試劑盒質(zhì)控體系主要考慮以下幾方面要求。
（1） 陽性對照品（質(zhì)控品）
建議對每個樣品反應(yīng)管設(shè)置至少一份陽性對照品（質(zhì)控品），陽性對照品應(yīng)參與樣本核酸的平行提取，以對樣本提取、試劑及儀器性能、擴增反應(yīng)過程等環(huán)節(jié)進行質(zhì)量控制，企業(yè)應(yīng)對各種陽性對照（質(zhì)控）品的Ct值做出明確的范圍要求。如樣本反應(yīng)管內(nèi)可以覆蓋多種突變序列的檢測（分型或不分型），相應(yīng)的陽性對照管可以不必涉及所有突變類型，但應(yīng)選擇較常見突變序列或理論上較難測得的突變序列作為陽性對照。
（2） 內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）
內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）可以對管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進行質(zhì)量控制，尤其是靶核酸為RNA、用于基因重排或基因表達(dá)異常等檢測目的時，可以采用管家基因或與靶基因濃度水平相當(dāng)?shù)钠渌蛐蛄凶鳛橄鄳?yīng)的內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）。申請人應(yīng)對內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）的引物、探針和模板濃度做精確驗證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制而導(dǎo)致假陰性。
（3） 陰性對照
陰性對照對可能存在的交叉污染進行假陽性結(jié)果的質(zhì)控。
生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料應(yīng)能對反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如臨床樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、質(zhì)控體系設(shè)置、Ct（臨界）值確定等，提供確切的依據(jù)，配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過程應(yīng)對pH、電導(dǎo)率等關(guān)鍵參數(shù)進行有效控制。主要包括以下內(nèi)容：
1. 主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式表示。
2. 反應(yīng)原理介紹。
3. 基因位點選擇、(RT)-PCR方法學(xué)特性介紹。
4. 確定最佳(RT)-PCR反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度等。
5. 確定逆轉(zhuǎn)錄過程（如涉及）的溫度和時間的研究資料，PCR反應(yīng)各階段溫度、時間及循環(huán)數(shù)的研究資料。
6. 對于基線閾值（threshold）和閾值循環(huán)數(shù)（Ct）確定的研究資料。
7. 不同適用機型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述。
8. 如申報產(chǎn)品包含核酸提取試劑，應(yīng)提交對核酸提取過程進行工藝優(yōu)化的研究資料。
企業(yè)應(yīng)提交在產(chǎn)品研制階段對試劑盒進行的所有性能驗證的研究資料，包括具體研究方法、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)、實驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細(xì)資料。建議著重對以下分析性能進行研究。如有相應(yīng)的國家參考品，應(yīng)在分析性能評估階段采用國家參考品對產(chǎn)品性能進行驗證。
1. 樣本核酸提取
樣本核酸的提取主要有以下目的：富集靶核酸濃度、保證靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，樣本核酸提取是決定后續(xù)核酸擴增過程成敗的要素之一。尤其是石蠟包埋組織樣本在福爾馬林固定過程中，會使樣品中的核酸與核酸之間，核酸與蛋白之間發(fā)生交聯(lián)，并且樣本在不當(dāng)?shù)谋４鏃l件下容易造成核酸的片段化或降解，增加了核酸提取的難度。因此，無論申報產(chǎn)品是否含有核酸分離/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)對核酸提取的環(huán)節(jié)做充分的驗證。除最大量分離出目的核酸外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化步驟，盡可能去除PCR抑制物。常見的核酸分離純化均有其優(yōu)勢和不足，申請人應(yīng)結(jié)合申報產(chǎn)品的特性，合理選擇核酸分離/純化試劑，并提供詳細(xì)的驗證資料。
2. 陽性/陰性參考品符合率
各水平、各突變位點的陽性參考品均應(yīng)按要求檢出陽性，考慮到濃度梯度的不同，應(yīng)對各水平陽性參考品設(shè)置相應(yīng)Ct值的限制；陰性參考品在各個引物探針組合的檢測條件下均應(yīng)檢出為陰性；如有野生型參考品的設(shè)置，在其相應(yīng)的引物探針組合下檢測應(yīng)為陽性。
3. 最低檢測限（分析靈敏度）
建議采用95%（n≥20）的陽性檢出率作為最低檢測限確定的標(biāo)準(zhǔn)，擴增反應(yīng)終體系中的突變序列百分率和總核酸濃度兩個因素對分析靈敏度的影響較大，終體系中突變序列的百分率越高、所含的DNA（RNA）量越多，則越容易檢出。因此，試劑盒最低檢測限主要考慮以下兩種情形。
（1） 在擴增反應(yīng)終體系特定核酸濃度下，突變序列所占百分率的最低檢測限。
采用野生型臨床樣本和較高突變百分率的臨床樣本提取的核酸儲備液進行混合，確定擴增反應(yīng)終體系中的核酸濃度，采用合理的試驗方法（如深測序）對混合后樣本中突變序列所占百分率進行確認(rèn)，并逐漸調(diào)整野生型和突變型核酸儲備液的比例以得到含不同突變序列百分率的混合液，對各份混合液進行不少于20次的重復(fù)檢測，確定95%陽性檢出率水平，作為在固定的核酸濃度條件下，可以檢測到的最低的突變序列百分率。
舉例：在50ng/40ul水平，可以達(dá)到95%陽性檢出率的最低突變序列百分率為10%。
（2） 在特定突變序列百分率下，反應(yīng)終體系中核酸濃度的最低檢測限。
采用合理的實驗方法確定待測樣本中的突變序列所占的百分率（如固定在10%的水平），再逐級稀釋成不同核酸濃度樣本，分別對各梯度濃度樣本進行不少于20次的重復(fù)檢測，確定95%陽性檢出率的最低DNA（RNA）濃度。
舉例：在10%的突變序列百分率水平，40ul擴增反應(yīng)終體系中，DNA濃度的最低檢測限為50ng/40ul。
（3） 評價腫瘤組織含量、DNA（RNA）降解等因素對分析靈敏度可能造成的影響。
4. 分析特異性
（1） 野生型驗證：采用不同濃度的野生型核酸樣本進行驗證，結(jié)果應(yīng)為陰性。
（2） 交叉反應(yīng)，對于此類產(chǎn)品的交叉反應(yīng)驗證主要考慮以下幾方面情形：
①申報試劑所覆蓋的全部突變類型間的交叉反應(yīng)；
②核酸序列具有同源性、易引起交叉反應(yīng)的野生型或其它突變類型間的交叉反應(yīng)。
申請人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗證的突變或野生型序列、序列確認(rèn)和濃度選擇等試驗資料。有關(guān)交叉反應(yīng)驗證的信息應(yīng)以列表的方式在產(chǎn)品說明書的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項中有所體現(xiàn)。
（3） 干擾物質(zhì)
①申請人應(yīng)根據(jù)試劑盒所采用的樣本類型，確定潛在的干擾物質(zhì)。
②用于干擾試驗的樣本，靶基因濃度應(yīng)至少包含弱陽性，而不應(yīng)僅選擇強陽性樣本，使用醫(yī)學(xué)相關(guān)水平的干擾物質(zhì)進行驗證。此外，建議申請人同時在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度(“最差條件”)條件下同樣進行評價。
有關(guān)干擾物質(zhì)的研究結(jié)果亦應(yīng)總結(jié)于產(chǎn)品說明書的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項下。
5. 精密度
測量精密度的評價方法并無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)可依，可根據(jù)不同產(chǎn)品特征或企業(yè)的研究習(xí)慣進行，前提是必須保證研究的科學(xué)合理性。具體實驗方法可以參考國際或國內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評估的文件進行。企業(yè)應(yīng)對每項精密度指標(biāo)的評價標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)的范圍等。針對本類產(chǎn)品的精密度評價主要包括以下要求。
（1） 對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除申報試劑（包括提取組分）本身的影響外，還應(yīng)對PCR分析儀、操作者、地點等要素進行相關(guān)的驗證。
（2） 合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天的連續(xù)檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，申請人應(yīng)選擇不同的實驗室進行重復(fù)實驗以對室間精密度進行評價。
（3） 用于精密度評價的質(zhì)控品應(yīng)至少包括3個水平:
①陰性參考品：待測靶核酸濃度低于最低檢測限或為零濃度，建議選用背景值較高的陰性樣本，陰性符合率應(yīng)為100%（n≥20）。
②弱陽性參考品：待測靶核酸濃度略高于試劑盒的最低檢測限，陽性檢出率應(yīng)達(dá)到100%（n≥20）。注：弱陽性參考品需包括所有的突變位點，如果待測物靶核酸為RNA，則弱陽性精密度參考品中應(yīng)至少部分典型突變位點的原料為RNA，如RNA干粉或相應(yīng)的假病毒。
③高濃度參考品：待測靶核酸呈中到強陽性的濃度，陽性檢出率為100%且CV≤15%（n≥20）。注：如果試劑盒可以覆蓋多個突變位點的檢測，該參考品可以設(shè)置為對全部突變位點進行精密度驗證，也可以選擇其中部分突變位點進行驗證，但應(yīng)至少包含常見突變序列或理論上較難測得的突變序列。
6. 其他需注意問題
對于適用多個機型的產(chǎn)品，應(yīng)提供如產(chǎn)品說明書【適用機型】項中所列的所有型號儀器的性能評估資料。若試劑盒適用的樣本類型不止一種，如既包含石蠟包埋組織切片亦包含冷凍組織切片或血液樣本等，則需對所有樣本類型的適用性進行評估，并提交評估資料。
對于此類試劑，參考值確定資料主要是指Ct值的確認(rèn)資料，建議申請人采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式對申報產(chǎn)品用于結(jié)果判斷的臨界值予以確認(rèn)。
穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、開瓶穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。
另外，樣本穩(wěn)定性的研究對于實驗的成敗也至關(guān)重要。特別是當(dāng)使用標(biāo)本類型包括組織標(biāo)本時，腫瘤組織標(biāo)本經(jīng)過特殊處理后其核酸序列的完整性容易遭到破壞，因此應(yīng)提供對樣本保存條件、保存時間等方面的詳細(xì)研究資料。樣本穩(wěn)定性研究主要包括核酸提取前樣本穩(wěn)定性和提取后核酸在儲備液中的穩(wěn)定性兩方面。在合理的溫度范圍內(nèi)選擇多個溫度點（應(yīng)至少包括范圍的上限和下限溫度），每間隔一定的時間段即對儲存樣本進行全性能的分析驗證，從而確認(rèn)不同類型樣本的穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對凍融次數(shù)進行評價。
試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細(xì)說明。
對于國內(nèi)外尚無同類產(chǎn)品被批準(zhǔn)上市的新的腫瘤相關(guān)基因突變，相關(guān)檢測試劑進行臨床研究時，申請人應(yīng)將試劑盒臨床研究納入相關(guān)藥物的臨床研究或臨床應(yīng)用中，通過對特定的腫瘤病人進行治療前后的跟蹤隨訪，以臨床對于患者個體化治療方案及有效性的綜合判斷為金標(biāo)準(zhǔn)，評價此類試劑用于指導(dǎo)腫瘤個體化用藥的臨床性能。研究者應(yīng)明確研究對象的入選標(biāo)準(zhǔn)、隨訪標(biāo)準(zhǔn)和隨訪時間。有關(guān)此類臨床研究的方案設(shè)計和評價標(biāo)準(zhǔn)等應(yīng)符合體外診斷試劑及藥物臨床研究相關(guān)法規(guī)要求。
對于已有同類產(chǎn)品上市的、基因突變與腫瘤個體化用藥方案的相關(guān)性已經(jīng)得到確認(rèn)的產(chǎn)品，則申請人既可采用試劑盒檢測與相關(guān)藥物治療相結(jié)合對特定的腫瘤病人進行治療前后的跟蹤臨床研究的方法，亦可在充分結(jié)合相關(guān)的病例信息的情況下，采用考核試劑與參比方法進行對比試驗的研究方法，對考核試劑的臨床應(yīng)用有效性進行評價。以下要求均針對采用對比試驗方法的臨床研究提出。
1. 參比方法的選擇可以考慮以下幾方面：
（1） 如已有同類產(chǎn)品上市，其臨床研究可以選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為參比試劑，采用擬申報產(chǎn)品（以下稱考核試劑）與之進行對比試驗研究，證明本品與已上市產(chǎn)品等效或優(yōu)于已上市產(chǎn)品。但應(yīng)充分考慮已上市同類試劑的突變位點選擇、靶序列選擇、分析靈敏度等特性，確?？己嗽噭┡c申報試劑具有明確可比性。
（2） 申請人亦可采用核酸序列測定方法作為此類試劑臨床試驗研究的參比方法，驗證考核試劑檢測結(jié)果與核酸序列測定結(jié)果之間的一致性情況。臨床研究報告中應(yīng)對選用的測序方法做詳細(xì)介紹，包括測序儀型號、相關(guān)引物設(shè)計、性能驗證和測序方法的質(zhì)量控制等資料，以及提供測序服務(wù)的機構(gòu)介紹和選擇依據(jù)等。
（3） 此外，在充分考慮檢測結(jié)果具有明確可比性的前提下，也可以選擇熒光原位雜交（FISH）或免疫組化等染色體或蛋白水平的檢測技術(shù)作為參比方法，但考慮到檢測結(jié)果之間不具有直接的可比性，建議對所有陽性病例采用其他分子生物學(xué)技術(shù)（如核酸序列測定）對結(jié)果予以確認(rèn)。
2. 臨床研究單位的選擇
建議申請人在選擇臨床單位時，應(yīng)在國內(nèi)不同區(qū)域選擇臨床單位，盡量使各單位的臨床樣本有一定的區(qū)域代表性；臨床研究單位應(yīng)具有分子病理診斷和分子生物學(xué)方法檢測的優(yōu)勢，實驗操作人員應(yīng)有足夠的時間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉評價方案。在整個實驗中，考核試劑和參比方法都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。
3. 臨床試驗方案
臨床試驗實施前，研究人員應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計科學(xué)合理的臨床研究方案。各臨床研究機構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預(yù)定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應(yīng)在臨床研究機構(gòu)的實驗室內(nèi)并由本實驗室的技術(shù)人員操作完成，申報單位的技術(shù)人員除進行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實驗進程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。
試驗方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床研究都應(yīng)記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結(jié)果時應(yīng)采用盲法以保證試驗結(jié)果的客觀性。各研究單位選用的參比試劑應(yīng)完全一致，以便進行合理的統(tǒng)計學(xué)分析。臨床方案中還應(yīng)明確確證試劑及方法。另外，考核試劑適用的樣本類型、可檢測的基因突變類型不應(yīng)超越參比試劑的相應(yīng)檢測要求，若此種情況發(fā)生，則應(yīng)選擇其他合理方法對額外的樣本類型和基因突變類型進行驗證。
4. 病例選擇及陽性病例比例
臨床試驗應(yīng)以腫瘤患者為研究對象，其中試劑盒規(guī)定范圍的每種突變類型均應(yīng)有一定量的陽性病例。對于陰性病例的選擇，也應(yīng)考慮到交叉反應(yīng)的需要，以從臨床角度考察其分析特異性。陰/陽性病例均應(yīng)覆蓋所有適用的腫瘤類型。若產(chǎn)品適用于多種樣本類型，則應(yīng)對所有樣本類型均進行臨床驗證。
5. 統(tǒng)計學(xué)分析
對臨床試驗結(jié)果的統(tǒng)計應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計方法，如檢測結(jié)果一致性分析、受試者工作特征（ROC）曲線分析、陰性/陽性符合率等。對于本類產(chǎn)品對比實驗的等效性研究，常選擇交叉四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對定性結(jié)果進行四格表χ2檢驗或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結(jié)果的一致性，統(tǒng)計分析應(yīng)可以證明兩種方法的檢測結(jié)果有無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。在臨床研究方案中應(yīng)明確統(tǒng)計檢驗假設(shè)，即評價考核試劑與參比試劑是否等效的標(biāo)準(zhǔn)。
6. 結(jié)果差異樣本的驗證
在數(shù)據(jù)收集過程中，對于兩種方法檢測結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)采用“金標(biāo)準(zhǔn)”方法或臨床上普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的第三種同類試劑進行復(fù)核，同時結(jié)合患者的臨床病情對差異原因及可能結(jié)果進行分析。
7. 臨床試驗總結(jié)報告撰寫
根據(jù)《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，臨床試驗報告應(yīng)該對試驗的整體設(shè)計及各個關(guān)鍵點給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對整個臨床試驗實施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析方法。建議在臨床總結(jié)報告中對以下內(nèi)容進行詳述。
（1） 臨床試驗總體設(shè)計及方案描述
①臨床試驗的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。
②病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)、不同年齡段人群的預(yù)期選擇例數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)。
③樣本類型，樣本的收集、處理及保存等。
④統(tǒng)計學(xué)方法、統(tǒng)計軟件、評價統(tǒng)計結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。
（2） 具體的臨床試驗情況
①臨床研究所用產(chǎn)品的名稱、批號、有效期及所用機型等信息，以及對比試驗產(chǎn)品的注冊情況。
②對各研究單位的病例數(shù)、年齡分布情況進行綜合分析，建議以列表或圖示方式給出具體例數(shù)及百分比。
③質(zhì)量控制，試驗人員培訓(xùn)、儀器日常維護、質(zhì)控品運行情況，對檢測精密度、質(zhì)控品測量值的抽查結(jié)果評估。
④具體試驗過程，樣本檢測、數(shù)據(jù)收集、樣本長期保存、結(jié)果不一致樣本的校驗等。
（3） 統(tǒng)計學(xué)分析
①數(shù)據(jù)預(yù)處理、差異數(shù)據(jù)的重新檢測或第三方驗證以及是否納入最終數(shù)據(jù)統(tǒng)計、對異常值或缺失值的處理、研究過程中是否涉及對方案的修改。
②陽性符合率、陰性符合率、總體符合率。
③以交叉四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對定性結(jié)果進行四格表χ2檢驗或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結(jié)果的一致性。
另外考慮到對不同樣本類型以及不同年齡段人群的檢測結(jié)果可能存在一定差異，故建議對不同樣本類型及不同年齡段人群分別進行統(tǒng)計分析，以對考核試劑的臨床性能進行綜合分析。
（4） 討論和結(jié)論
對總體結(jié)果進行總結(jié)性描述并簡要分析試驗結(jié)果，對本次臨床研究有無特別說明，最后得出臨床試驗結(jié)論。
1. 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) polymerase chain reaction, PCR：
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種對特定的DNA或RNA片段在體外進行快速擴增的方法。由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。
2. 雜交 hybridization
具有一定同源序列的兩條核酸單鏈（DNA或RNA）可以通過氫鍵的方式，按堿基互補配對原則相結(jié)合。
3. 熒光探針PCR
在PCR過程中利用熒光染料釋放的熒光能量的變化直接反映出PCR擴增產(chǎn)物量的變化，并通過對熒光的采集和分析以達(dá)到對原始模板量進行分析的PCR。
4. 分析特異性 analytical specificity
測量程序只測量被測量物的能力。分析特異性用于描述檢測程序在樣本中有其他物質(zhì)存在時只測量被測量物的能力。通常以一個被評估的潛在干擾物清單來描述，并給出在特定醫(yī)學(xué)相關(guān)濃度值水平的分析干擾程度。
注：潛在干擾物包括干擾物和交叉反應(yīng)物。
5. 精密度 precision
在規(guī)定條件下，相互獨立的測試結(jié)果之間的一致程度。精密度的程度是用統(tǒng)計學(xué)方法得到的測量不精密度的數(shù)字形式表示，如標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）。
6. 檢測限 detection limit, limit of detection
樣品中以一定概率可被聲明與零有差異的被測測量的最低值。
7. 閾值循環(huán)數(shù) cycle threshold, Ct
實時監(jiān)測擴增過程中，反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)指數(shù)擴增時經(jīng)歷的循環(huán)周期數(shù)。主要的計算方式是以擴增過程前3到15個循環(huán)的熒光值的10倍標(biāo)準(zhǔn)差為閾值，當(dāng)熒光值超過閾值時的循環(huán)數(shù)則為閾值循環(huán)數(shù)（Ct）。
8. 突變 mutation
是細(xì)胞中DNA核苷酸序列發(fā)生了穩(wěn)定的可遺傳的改變。
9. 內(nèi)標(biāo) internal control
在同一反應(yīng)管中與靶序列共同擴增的一段非靶序列分子，其目的是鑒別儀器故障、試劑因素、聚合酶活性因素或樣本中存在抑制物等造成的結(jié)果不理想的原因。
1. 《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》,（國食藥監(jiān)械〔2007〕229號）,2007年4月19日
2. 《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》,（國食藥監(jiān)械〔2007〕240號）,2007年4月28日
3. 《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》,（國食藥監(jiān)械〔2007〕240號）,2007年4月28日
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