附件6：

體外診斷試劑生產(chǎn)及質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則

——生物芯片類試劑生產(chǎn)及質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則

（征求意見稿）

前   言

本指導(dǎo)原則所定義的生物芯片診斷試劑是指將多個生物探針（包括DNA片段，寡核苷酸、抗原、抗體，組織，細(xì)胞等）按預(yù)先設(shè)計的排列方式固定在特制的基質(zhì)（包括玻璃片，尼龍膜，硝酸纖維素膜等）上，用特定的方法提取生物靶分子并進(jìn)行標(biāo)記，然后與固定在基質(zhì)上的生物探針特異性的結(jié)合，再用相應(yīng)的檢測設(shè)備（如激光掃描儀、CCD檢測儀等）和分析方法（包括軟件）進(jìn)行檢測、記錄、分析，實現(xiàn)對生物靶分子的定性或定量檢測的試劑。

根據(jù)芯片制作的主要原料和方法，生物芯片可分為核酸芯片、蛋白芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片、芯片實驗室等。本指導(dǎo)原則是針對核酸和蛋白為檢測靶分子生物芯片的生產(chǎn)及質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則，其它類型靶分子檢測的芯片診斷試劑可參考本指導(dǎo)原則。

由于生物芯片技術(shù)還在不斷發(fā)展，國家食品藥品監(jiān)督管理部門可依據(jù)科學(xué)技術(shù)發(fā)展的需要，適時組織對本指導(dǎo)原則進(jìn)行修訂。

一、基本原則

（一）生物芯片診斷試劑生產(chǎn)用的物料包括：原料，輔料和包裝材料。各種物料應(yīng)當(dāng)制定相應(yīng)的質(zhì)量指標(biāo)，并應(yīng)符合有關(guān)法規(guī)的要求。

（二）生物芯片診斷試劑的生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)具備相應(yīng)的專業(yè)技術(shù)人員，相適應(yīng)的儀器設(shè)備和生產(chǎn)環(huán)境，獲得《醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證》；應(yīng)當(dāng)按照《體外診斷試劑生產(chǎn)實施細(xì)則（試行）》的要求建立相應(yīng)的質(zhì)量管理體系，形成文件和記錄，加以實施并保持有效運(yùn)行；應(yīng)當(dāng)通過《體外診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量管理體系考核評定標(biāo)準(zhǔn)（試行）》的考核。

（三）生物芯片診斷試劑的研制應(yīng)當(dāng)按照科學(xué)、規(guī)范的原則組織研發(fā)，各反應(yīng)條件的選擇和確定應(yīng)符合基本的科學(xué)原理。

（四）生物芯片診斷試劑生產(chǎn)過程中所用的物料及工藝，應(yīng)充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜。

二、物料質(zhì)量控制

（一）核酸檢測芯片

核酸芯片檢測時，從生物樣本中提取的核酸可用熒光標(biāo)記、金標(biāo)記和酶標(biāo)記。檢測方法包括光譜學(xué)方法和化學(xué)顯色。下面為熒光標(biāo)記芯片技術(shù)指導(dǎo)原則，采用金標(biāo)記和酶聯(lián)顯色等的生物芯片診斷試劑可參照核酸芯片和蛋白芯片相關(guān)部分。

1、主要生物原料

核酸檢測芯片的主要生物原料包括模板DNA、dNTPs、引物、探針、標(biāo)記物等。應(yīng)按照工藝要求對這類生物原料進(jìn)行質(zhì)量檢驗，以保證其達(dá)到規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。主要生物原料的供應(yīng)商要求相對固定，不得隨意變更供應(yīng)商。

（1）模板DNA

重組DNA：經(jīng)測序驗證，關(guān)鍵位置沒有錯誤。1×TE溶解，濃度為1μg/μl以上，-20℃保存。

（2）dNTPs（dATP/dUTP/dGTP/dCTP/dTTP）

HPLC純，PCR級，無DNase、RNase污染。-20℃以下保存。外購者，由生產(chǎn)廠家提供質(zhì)量保證證明，達(dá)到生產(chǎn)要求。

（3）引物

序列確證；進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，克隆測序鑒定驗證，建立引物標(biāo)準(zhǔn)品。生產(chǎn)中的引物原材料為凍干粉，PAGE純或HPLC純，外購者，供應(yīng)商應(yīng)提供該產(chǎn)品的質(zhì)檢證明，如PAGE電泳結(jié)果或HPLC分析圖譜；自己合成的引物，需有PAGE電泳結(jié)果或HPLC分析圖譜。用標(biāo)準(zhǔn)DNA模板擴(kuò)增，電泳檢測，譜帶單一，大小正確，與對照引物比較，產(chǎn)物量一致。符合視為合格引物。-20℃以下保存。

（4）探針（用于陣列制備）

重組DNA, 凍干粉（或1×TE溶解液）：每種90μg以上，酶切鑒定分析圖譜。

PCR產(chǎn)物，凍干粉（或1×TE溶解液）：每種90μg以上，PCR電泳鑒定圖譜。

合成寡核苷酸：PAGE純或HPLC純，每種90μg以上，提供該產(chǎn)品的PAGE電泳分析圖譜或HPLC分析圖譜。外購者，供應(yīng)商應(yīng)提供質(zhì)量保證證明，達(dá)到生產(chǎn)要求。

探針序列的正確性：應(yīng)用克隆鑒定的標(biāo)準(zhǔn)DNA雜交鑒定或進(jìn)行測序鑒定。外購者，供應(yīng)商應(yīng)提供質(zhì)量保證證明，達(dá)到生產(chǎn)要求。

純度和濃度檢測：用電泳方法，電泳圖譜沒有雜帶，目標(biāo)條帶的強(qiáng)度與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)DNA條帶進(jìn)行參比計算其強(qiáng)度。純度較高的DNA，可用紫外分光光度計進(jìn)行定量。檢定合格后入庫。避光、-20℃以下保存。

（5）標(biāo)記物

含有激發(fā)光波長和發(fā)射光波長介于280~680nm的所有熒光分子，HPLC純，供應(yīng)商應(yīng)提供質(zhì)量保證證明。

（6）Taq DNA聚合酶

SDS-PAGE 檢測，純度＞95%，具DNA聚合酶活性，無核酸外切酶活性及核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性，94℃1小時后仍保持50％活性，由供應(yīng)商提供質(zhì)量保證。-20℃保存。

（7）UNG（尿嘧啶糖基化酶）

具尿嘧啶糖基化酶活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性。1U UNG 37℃處理3分鐘后，103拷貝以下含U模板被降解后，不能產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，供應(yīng)商提供質(zhì)量保證。-20℃保存。

（8）RT 酶

具有逆轉(zhuǎn)錄活性，供應(yīng)商提供質(zhì)量保證。-20℃保存。

（9）RT-PCR酶

具逆轉(zhuǎn)錄酶活性和DNA聚合酶活性，無核酸外切酶活性及核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性，94℃1小時后仍保持50％活性。-20℃保存。

（10）緩沖液

各類酶制品需要的的反應(yīng)緩沖液由廠家隨酶制品提供，供應(yīng)商提供質(zhì)量保證。-20℃保存。

2、主要生物輔料

（1）雜交液

購買成品者，供應(yīng)商提供質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并按要求保存。自制雜交液，按半成品檢定標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行檢定。

（2）酶類

蛋白酶、核酸酶等，供應(yīng)商提供質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并按要求保存。

（3）核酸提取試劑

供應(yīng)商提供質(zhì)量保證，并按要求保存。如果是自制提取液，按半成品檢定要求。

（4）魚精DNA

供應(yīng)商提供質(zhì)量保證，并按要求保存。

（5）封閉用蛋白

包括牛血清白蛋白，奶粉等，提供質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并按要求保存。

3、主要化學(xué)原輔料

參照《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)（2000年版）》分析純級別進(jìn)行檢驗。主要的檢測指標(biāo)包括：溶液外觀、一般鹽類檢測、溶液pH值檢測、溶解情況檢測、干燥失重的檢測、熾灼殘渣等。

主要化學(xué)原材料的供應(yīng)商要求相對固定，不得隨意發(fā)生變更?；瘜W(xué)原材料在購入時，原材料的生產(chǎn)商必須提供該批次化學(xué)原材料的質(zhì)量質(zhì)量保證材料和質(zhì)量檢驗報告，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)達(dá)到生產(chǎn)所需的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

（1）無機(jī)類

主要包括氯化鈉、氫氧化鈉、純化水等。

（2）有機(jī)類

主要包括有丙酮、乙醇、枸櫞酸、吐溫20、乙二胺四乙酸二鈉、氨基吡啉等。

（3）特殊化學(xué)原料

聚乙二醇，多聚賴氨酸，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，N,N,N',N'-四甲基二乙胺（TEMED）、溴化乙錠（EB）、染色劑等。

4、其他物料

（1）載玻片

外觀：明亮處用肉眼觀察無缺刻，無劃傷等。規(guī)格按設(shè)計要求。

激光掃描儀掃描（波長為芯片檢測波長）：包被層基本均勻。

（2）試管、吸頭、試劑瓶等

一次性使用，由生產(chǎn)廠家提供質(zhì)量保證，達(dá)到設(shè)計要求。

（3）其他：說明書、包裝外盒等

參照國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》和《醫(yī)療器械說明書、標(biāo)簽和包裝標(biāo)識管理規(guī)定》執(zhí)行。

（二）蛋白檢測芯片

1、主要生物原料

與生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量最密切相關(guān)的生物原料包括各種活性抗原、重組抗原、單克隆杭體、多克隆抗體以及多肽類生物原科。這類原料可用于點(diǎn)膜、標(biāo)記相關(guān)酶、納米金、光學(xué)基團(tuán)及中和反應(yīng)用抗原或抗體等。使用前應(yīng)按工藝要求對這類生物原料進(jìn)行質(zhì)量檢驗，以保證其達(dá)到規(guī)定的質(zhì)量要求。主要生物原料若為企業(yè)自己生產(chǎn)，其工藝必須相對穩(wěn)定；若購買，其供應(yīng)商要求相對固定，不能隨意變更供應(yīng)商，如果主要原料（包括工藝）或其供應(yīng)商有變更，必須進(jìn)行原料驗證，并進(jìn)行補(bǔ)充申報。

主要生物原料的常規(guī)檢驗項目一般包括：

（1）外觀

肉眼觀察，大部分生物原料為澄清透明的液體，不含異物，渾濁或搖不散的沉淀；或者為白色粉末，不含有其他顏色的雜質(zhì)；特殊生物原料應(yīng)具備相應(yīng)外觀標(biāo)準(zhǔn)。

（2）純度和分子量

主要通過SDS-PAGE電泳和電泳結(jié)果掃描儀進(jìn)行檢測，也可用其他適宜的方法，如高效液相法等。作為免疫診斷試劑用生物原材料，用銀染法染色后，純度一般都要大于90％；用考瑪氏亮藍(lán)染色后；純度一般都要大于95％。SDS凝膠電泳法測定分子量。

（3）蛋白濃度

蛋白濃度可通過Lowry法、280nm光吸收法、雙縮脲方法等進(jìn)行檢測；

（4）效價

效價的測定一般根據(jù)蛋白含量測定結(jié)果通過倍比稀釋法進(jìn)行。效價應(yīng)達(dá)到設(shè)計規(guī)定的要求。

（5）功能性實驗

功能性實驗是指生物原料用于試劑盒試劑實際生產(chǎn)中的情況，一般考查該原料使用后的試劑靈敏度、特異性和穩(wěn)定性。

2、主要生物輔料

生物輔料指的是在生產(chǎn)過程中作為蛋白保護(hù)劑用途的一類生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。這些生物原料均應(yīng)按照《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)（2000年版）》所規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行檢驗，達(dá)到相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后方應(yīng)用于生產(chǎn)。

生物輔料的供應(yīng)商同樣要求相對固定，不得隨意變更供應(yīng)商。

對于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，還應(yīng)進(jìn)行功能性實驗，即以其為原料配制10％濃度的稀釋液作為樣品，進(jìn)行酶聯(lián)免疫測定，均不得出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。

對于標(biāo)記用酶，應(yīng)在產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中明示所使用的標(biāo)記用酶的名稱（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等），同時應(yīng)根據(jù)不同生產(chǎn)廠家的檢定方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗，酶的純度RZ值（OD403nm/OD280nm）應(yīng)大于3.0。

3、化學(xué)原輔料

參照《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)（2000年版）》分析純級別進(jìn)行檢驗。主要的檢測指標(biāo)包括：溶液外觀、一般鹽類檢測、溶液pH值檢測、溶解情況檢測、干燥失重的檢測、熾灼殘渣等。

主要化學(xué)原材料的供應(yīng)商要求相對固定，不得隨意發(fā)生變更?；瘜W(xué)原材料在購入時，原材料的生產(chǎn)商必須提供該批次化學(xué)原材料的質(zhì)量質(zhì)量保證材料和質(zhì)量檢驗報告，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)達(dá)到生產(chǎn)所需的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

（1）無機(jī)類

主要包括氯化鈉、氫氧化鈉、純化水等。

（2）有機(jī)類

主要包括有丙酮、乙醇、枸櫞酸、吐溫20、乙二胺四乙酸二鈉、氨基吡啉等。

（3）特殊化學(xué)原料

DAB（聯(lián)苯二胺），染色劑等。

4、其他物料

（1）基質(zhì)

以硝酸纖維素膜為例：孔徑符合設(shè)計要求（0.45μm、0.22μm等）、均一性（厚度及毛細(xì)遷移速度±20％）、尺寸（與標(biāo)識吻合）

（2）瓶子和干燥劑

由生產(chǎn)廠家提供質(zhì)量保證，達(dá)到規(guī)定要求。

（3）其他：說明書、包裝外盒等

應(yīng)參照國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》和《醫(yī)療器械說明書、標(biāo)簽和包裝標(biāo)識管理規(guī)定》執(zhí)行。

三、試劑盒各組分的生產(chǎn)

生物芯片主要包括DNA芯片、蛋白芯片、組織芯片、細(xì)胞芯片以及芯片實驗室等。生物芯片診斷試劑產(chǎn)品基本可分成二個部分，一部分是芯片，另一部分檢測用工作液。如果有配套的檢測儀器，還需對儀器及處理軟件的應(yīng)用加以說明。

（一）芯片的生產(chǎn)

芯片生產(chǎn)的基本過程包括探針的獲取方法，純化，點(diǎn)樣，固定。

1、探針獲取

不同的芯片，主要是探針不同，生物芯片的探針主要包括以下幾類，其它探針可參考制定相應(yīng)的技術(shù)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

（1）DNA探針的獲取

探針的形式有PCR產(chǎn)物、克隆DNA、人工合成DNA片段等；要求有生產(chǎn)程序和質(zhì)量指標(biāo)及檢測方法，要進(jìn)行純化，有固定的純化程序。

（2）抗原的生產(chǎn)

抗原的獲得方法包括細(xì)胞培養(yǎng)、從生物材料中分離提取、基因工程表達(dá)以及合成肽等。基因工程表達(dá)產(chǎn)物又分為純抗原蛋白、融合蛋白等。

（3）抗體

抗體分單克隆抗體和多克隆抗體?？贵w制備包括細(xì)胞培養(yǎng)，動物腹水，基因工程表達(dá)等方式。

（4）細(xì)胞和組織

包括細(xì)胞或組織類型，固定方法。組織材料還包括固定，包埋，切片等。

（5）芯片實驗室，包括各種管道泵的制作等。

2、陣列的排列設(shè)計

陣列的排列包括依次排列、隨機(jī)排列、對角線排列等，設(shè)計時需考慮重復(fù)次數(shù)等。

3、點(diǎn)陣的制作

使用儀器的要確定型號，程序；手工制作的也要有標(biāo)準(zhǔn)操作程序。

4、固定：包括固定方式，固定的條件等。

應(yīng)對芯片生產(chǎn)的過程進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量控制，如點(diǎn)樣和固定過程的監(jiān)控、點(diǎn)樣均一性檢驗等。

（二）工作液配制

1、芯片生產(chǎn)所需試劑，包括細(xì)胞培養(yǎng)基，探針制備試劑，陣列制作和固定試劑等。

2、樣品處理試劑，芯片檢測靶分子分為核酸和蛋白質(zhì)。檢測核酸的樣品處理試劑包括臨床取樣，DNA提取或RNA提取試劑，逆轉(zhuǎn)錄試劑，PCR擴(kuò)增試劑，核酸標(biāo)記試劑等；檢測蛋白的處理試劑包括取樣試劑，蛋白稀釋液以及特殊試劑等。

3、反應(yīng)液：檢測核酸時的反應(yīng)液包括預(yù)雜交液，雜交液，洗脫液等；檢測蛋白時，包括封閉液，抗原/抗體反應(yīng)液，洗脫液，顯色液，顯色終止液等。

（三）數(shù)據(jù)判讀

1、判斷標(biāo)準(zhǔn)及依據(jù)，包括Cut off值的確定依據(jù)。 

2、數(shù)據(jù)判讀方式：人工還是軟件判讀。

3、如果是軟件判讀，應(yīng)提供軟件判斷的科學(xué)依據(jù)（包括生物學(xué)原理、數(shù)據(jù)獲取原理和判斷實驗是否成立的依據(jù)）以及實驗測試的原始報告（或數(shù)據(jù)），并需要說明：

（1）軟件的來源：購買或自己編制，是否獲得注冊等。

（2）軟件的用途：包括對數(shù)據(jù)的分析、存儲、解讀、含義等。

（3）軟件的使用：基本的使用程序。

四、半成品質(zhì)量控制

（一）抽樣

檢驗人員按批號抽取檢定需要數(shù)量的半成品，作好標(biāo)記，待檢。

（二）質(zhì)控品 

可用克隆并測序鑒定的DNA或經(jīng)特異性鑒定的抗原（或抗體）。質(zhì)控品的基質(zhì)應(yīng)盡可能與被測物基質(zhì)相一致。

（三）檢定要求

1、芯片檢定

（1）靈敏度：最低檢測限達(dá)到規(guī)定要求。

（2）特異性：應(yīng)達(dá)到規(guī)定要求。若進(jìn)行全陰、全陽和交叉反應(yīng)檢測，全陰性檢測應(yīng)在沒有靶分子存在時，所有檢測位點(diǎn)沒有檢測信號；全陽性檢測應(yīng)在加入足夠量的靶分子，所有檢測位點(diǎn)均有檢測信號；交叉反應(yīng)檢測時，用某一位點(diǎn)的靶分子檢測，應(yīng)只有該位點(diǎn)有檢測信號，其它位點(diǎn)不能有檢測信號。

（3）精密性（均一性）：用比最低檢測限高一個數(shù)量級的質(zhì)控品，重復(fù)檢測10次，判定結(jié)果一致。

考慮到芯片的多位點(diǎn)檢測，因此要進(jìn)行全位點(diǎn)和單個位點(diǎn)進(jìn)行檢測。半成品檢定可以用克隆DNA和鑒定的抗原和抗體作質(zhì)控品。

2、工作液的檢定

（1）物理檢測：外觀顏色正常，沒有雜質(zhì)。

（2）質(zhì)量檢定：用被檢定的工作液檢測標(biāo)準(zhǔn)樣，檢測結(jié)果達(dá)到預(yù)定要求。

五、成品質(zhì)量控制

（一）生產(chǎn)批量

申報生產(chǎn)的批量每批原則上不低于1000人份。

（二）抽樣

檢驗人員按批號抽取檢定需要數(shù)量的半成品，做好標(biāo)記，待檢。

（三）標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）

應(yīng)用國家標(biāo)準(zhǔn)品或參考品進(jìn)行檢定，若無國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品），可以使用企業(yè)參考品，但其標(biāo)準(zhǔn)不得低于第一家已經(jīng)獲得批準(zhǔn)的該類試劑。

（四）檢定要求

1、靈敏度：應(yīng)達(dá)到規(guī)定要求。

2、特異性：應(yīng)達(dá)到規(guī)定要求。

3、精密性（均一性）：對某一樣本，重復(fù)10次，對病種的定性檢測結(jié)果一致。

4、穩(wěn)定性（僅對蛋白芯片）

37℃放置至少3天，靈敏度、特異性和精密度仍達(dá)到規(guī)定要求。熱加速破壞試驗的時間長短，可由生產(chǎn)單位根據(jù)不同產(chǎn)品在37℃貯存與常溫貯存（2℃~8℃）中質(zhì)量變化的相關(guān)性來決定。