附件3：

體外診斷試劑生產(chǎn)及質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則

——核酸檢測(cè)試劑生產(chǎn)及質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則

（征求意見(jiàn)稿）

核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)泛指以擴(kuò)增DNA或RNA為手段，從而篩查特定基因的檢測(cè)技術(shù)，如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、連接酶鏈反應(yīng)（LCR）、轉(zhuǎn)錄依賴(lài)的擴(kuò)增反應(yīng)（TMA）等。核酸檢測(cè)試劑是基于核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的體外診斷試劑，目前已經(jīng)用于病原體檢測(cè)、特定疾病的早期診斷和體內(nèi)物質(zhì)的型別鑒定等不同領(lǐng)域。為規(guī)范核酸檢測(cè)試劑的生產(chǎn)及質(zhì)量控制，特制定本技術(shù)指導(dǎo)原則，并將根據(jù)核酸檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展?fàn)顩r適時(shí)進(jìn)行修改。

一、基本要求

1、核酸類(lèi)檢測(cè)試劑的生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)獲得《醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證》。

2、核酸類(lèi)檢測(cè)試劑的生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)具有與其技術(shù)要求相適應(yīng)的人員、環(huán)境、設(shè)施和儀器設(shè)備等條件，建立專(zhuān)用實(shí)驗(yàn)室，配備滿(mǎn)足核酸提取和擴(kuò)增檢測(cè)以及操作人員防護(hù)所需的設(shè)備。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格分區(qū)，人員和物品應(yīng)當(dāng)單向流動(dòng)，以最大限度地防止實(shí)驗(yàn)過(guò)程中樣品之間的污染和避免擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。

3、核酸類(lèi)檢測(cè)試劑的生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)按照《體外診斷試劑生產(chǎn)實(shí)施細(xì)則（試行）》的要求，建立相應(yīng)的質(zhì)量管理體系，并應(yīng)通過(guò)《體外診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量管理體系考核評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)（試行）》的考核。

4、核酸類(lèi)檢測(cè)試劑的生產(chǎn)單位應(yīng)當(dāng)對(duì)試劑的使用范圍作出明確規(guī)定，并經(jīng)國(guó)家藥品管理部門(mén)批準(zhǔn)。引物設(shè)計(jì)應(yīng)當(dāng)符合核酸檢測(cè)設(shè)計(jì)的要求，擴(kuò)增體系應(yīng)設(shè)定合理的內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)，試劑須設(shè)置抗污染的特定措施，擴(kuò)增產(chǎn)物須進(jìn)行確證研究。

5、核酸類(lèi)檢測(cè)試劑的原材料應(yīng)制訂相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)符合現(xiàn)行《中國(guó)藥典》或《中國(guó)生物制品主要原輔料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》的要求。使用未列入上述標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)試劑，應(yīng)不低于分析純。

二、原材料

應(yīng)提供主要原材料如引物、探針、企業(yè)參考品或標(biāo)準(zhǔn)品等的選擇與來(lái)源、制備過(guò)程、質(zhì)量分析和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等的相關(guān)研究資料。如果主要原材料來(lái)自市場(chǎng)（從其他單位購(gòu)買(mǎi)），應(yīng)提供的資料包括：對(duì)物料供應(yīng)商審核的相關(guān)資料、購(gòu)買(mǎi)合同、供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報(bào)告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。

核酸類(lèi)檢測(cè)試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無(wú)DNase和RNase污染。

1、dNTP

脫氧三磷酸核苷，核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP。應(yīng)為HPLC純、PCR級(jí)，無(wú)DNase和RNase污染。-20℃保存。

2、引物

由一定數(shù)量的核苷酸構(gòu)成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化。

凍干粉，1800D以上。序列正確。純度應(yīng)達(dá)到電泳級(jí)（PAGE）或HPLC級(jí)，不含雜帶。應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如PAGE電泳結(jié)果或HPLC分析圖譜。

應(yīng)作HPLC分析和紫外光吸收分析。以紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260nm/OD280nm的比值在1.6~2.0之間，可視為合格引物。-20℃保存。

3、探針

是指特定的帶有示蹤物（標(biāo)記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測(cè)。通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化，在5'-端標(biāo)記熒光素報(bào)告基團(tuán)或其他發(fā)光標(biāo)記物，在3'-端標(biāo)記熒光素淬滅基團(tuán)，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化。

凍干粉，90D以上。純度應(yīng)達(dá)到HPLC純，不含雜帶。應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如HPLC分析圖譜；應(yīng)對(duì)探針的核酸序列及標(biāo)記的熒光素或化學(xué)發(fā)光物進(jìn)行核實(shí)，并作HPLC分析。應(yīng)以可見(jiàn)—紫外分光光度計(jì)進(jìn)行200~800nm掃描，在260nm處應(yīng)有吸收峰。另外，根據(jù)標(biāo)記的熒光素的不同，還應(yīng)該在熒光素的激發(fā)波長(zhǎng)處有吸收峰，如FAM熒光素在494nm、TET熒光素在521nm、TAMRA熒光素在560nm處有特異的吸收峰，雜交探針在493nm、625nm、685nm處有特異的吸收峰，檢定合格后入庫(kù)。避光、-20℃保存。

4、Taq DNA聚合酶

具有DNA聚合酶活性，無(wú)核酸外切酶活性及核酸內(nèi)切酶活性；具熱穩(wěn)定性，94℃保溫1小時(shí)后仍保持50%活性。-20℃保存。

5、UNG（尿嘧啶糖基化酶）

具有尿嘧啶糖基化酶活性，無(wú)核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性，IU UNG在 37℃處理3分鐘后，103拷貝以下含U模版應(yīng)完全降解，不能產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。-20℃保存。

6、RT-PCR酶（反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增酶）

具逆轉(zhuǎn)錄酶活性和DNA聚合酶活性，無(wú)核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性；具熱穩(wěn)定性，94℃1小時(shí)后仍保持50%活性，-20℃保存。

三、生產(chǎn)工藝

核酸類(lèi)檢測(cè)試劑的基本生產(chǎn)工藝通常包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過(guò)程應(yīng)對(duì)pH、電導(dǎo)率等關(guān)鍵

參數(shù)進(jìn)行有效控制。

工藝研究的資料應(yīng)能對(duì)反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容如樣本類(lèi)型、樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、校準(zhǔn)方法、質(zhì)控方法、

臨界值的確定、穩(wěn)定性和有效期，提供確切的依據(jù)。

四、質(zhì)量控制

（一）半成品質(zhì)量控制

1、按批號(hào)抽取規(guī)定數(shù)量的半成品。

2、以參考品／對(duì)照品進(jìn)行半成品質(zhì)量控制。如果產(chǎn)品具有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或參考品，應(yīng)以其進(jìn)行檢定。如果產(chǎn)品不具有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或參考品，應(yīng)根據(jù)規(guī)定制備相應(yīng)的參考品，或以經(jīng)標(biāo)化的質(zhì)

粒進(jìn)行半成品檢定。

3、半成品檢定內(nèi)容包括：對(duì)照品符合率、靈敏度、特異性、

精密度。結(jié)果應(yīng)符合要求。

4、半成品檢定合格后，按試劑盒組成及時(shí)進(jìn)行分裝和包裝。

（二）成品質(zhì)量控制

1、產(chǎn)品完成包裝后，應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)量進(jìn)行抽樣和生產(chǎn)記錄審

核。

2、以參考品／對(duì)照品或參考品，或以經(jīng)標(biāo)化的質(zhì)粒進(jìn)行成

品質(zhì)量檢驗(yàn)。結(jié)果應(yīng)符合要求。

3、成品檢驗(yàn)的內(nèi)容應(yīng)包括：對(duì)照品符合率、靈敏度、特異性、精密度、線(xiàn)性和穩(wěn)定性。穩(wěn)定性試驗(yàn)可采用加速破壞試驗(yàn)。