PCR的基本原理和概念
1983年美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain re action,PCR),1985年公開(kāi)報(bào)道,使人們能在試管內(nèi)以幾小時(shí)的反應(yīng)將DNA擴(kuò)增10^9倍.1987年P(guān)CR得到美國(guó)的專(zhuān)利權(quán),PCR技術(shù)在生命科學(xué)中掀起了一場(chǎng)革命,并形成了巨大的市場(chǎng),有人預(yù)言,本世紀(jì)末PCR產(chǎn)值可達(dá)到4x10^8美元.本章介紹PCR的原理、常用的各種PCR方法及主要應(yīng)用范圍.
一、基本原理
DNA在細(xì)胞中的復(fù)制是—個(gè)比較復(fù)雜的過(guò)程.參與復(fù)制的基本因素有：DNA聚合酶、DNA連接酶、DNA模板、由引發(fā)酶合成的RNA引物、核苷酸原料、無(wú)機(jī)離子、合適的pH、以及解開(kāi)DNA的超螺旋及雙螺旋等結(jié)構(gòu)的若干酶與蛋白質(zhì)因子等.
PCR是在試管中進(jìn)行DNA復(fù)制反應(yīng),基本原理與體內(nèi)相似,不同之處是耐熱的Taq酶取代DNA聚合酶,用合成的DNA引物替代RNA引物,用加熱(變性)、冷卻(退火、保溫(延伸)等改變溫度的辦法使DNA得以復(fù)制,反復(fù)進(jìn)行變性、退火、延伸循環(huán),就可使DNA無(wú)限擴(kuò)增.PCR的具體過(guò)程如下：
將PCR反應(yīng)體系升溫至95℃左右,雙鏈的DNA模板就解開(kāi)成兩條單鏈,此過(guò)程為變性.然后將溫度降至引物的Km值以下,3'端與5'端的引物各自與兩條單鏈DNA模板的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合,此過(guò)程稱(chēng)為退火.當(dāng)將反應(yīng)體系的溫度升至70℃左右時(shí),耐熱的Taq DNA聚合酶催化四種脫氧核糖核苷酸按照模板DNA的核苷酸序列的互補(bǔ)方式依次加至引物的3'端,形成新生的DNA鏈.每一次循環(huán)使反應(yīng)體系中的DNA分子數(shù)增加約一倍.理論上循環(huán)幾次,就增加為2^n倍.當(dāng)經(jīng)30次循環(huán)后,DNA產(chǎn)量達(dá)2^30拷貝,約為10^9個(gè)拷貝.PCR擴(kuò)增過(guò)程見(jiàn)圖8-1.由于實(shí)際上擴(kuò)增效率達(dá)不到2倍,因而應(yīng)為（1+R）^n,R為擴(kuò)增效率.
二、參與PCR反應(yīng)體系的因素及其作用
參與PCR反應(yīng)的因素主要包括模板核酸、引物、TaqDNA聚合酶、緩沖液、Mg2+、三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)、反應(yīng)溫度與循環(huán)次數(shù)、PCR儀等.現(xiàn)對(duì)它們的作用介紹如下：
(一)模板核酸
用于PCR的模板核酸可以是DNA,也可以是RNA.當(dāng)用RNA作模板時(shí),首先要進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA,然后再進(jìn)行正常的PCR循環(huán).核酸模板來(lái)源廣泛,可以從培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌、病毒、組織、病理標(biāo)本、考古標(biāo)本等中提取.
PCR反應(yīng)時(shí)加入的DNA模板量一般為100-100000拷貝,現(xiàn)在的技術(shù)水平已能從單個(gè)細(xì)胞制備出相應(yīng)的cDNA文庫(kù).DNA模板含量合適,可以減少PCR多次循環(huán)帶來(lái)的堿基錯(cuò)配.
通常模板DNA用線(xiàn)性DNA分子,若為環(huán)狀質(zhì)粒,最好先用酶將其切開(kāi)成線(xiàn)狀分子,因?yàn)榄h(huán)狀DNA復(fù)性太快.
(二)引物
引物決定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性與長(zhǎng)度.因此,引物設(shè)計(jì)決定PCR反應(yīng)的成敗.
PCR反應(yīng)中有兩種引物,即5'端引物與3'端引物.5'端引物是指與模板5'端序列相同的寡核苷酸,3'端引物是指與模板3'端序列互補(bǔ)的寡核苷酸.對(duì)引物的基本要求有：①引物的長(zhǎng)度過(guò)短會(huì)影響PCR的特異性,要求有16-30bp,因?yàn)?^16=4.29x10^9,已大于哺乳動(dòng)物基因組3x10^9bp,保證了特異性結(jié)合；引物過(guò)長(zhǎng)使延伸溫度超過(guò)Taq DNA聚合酶的最適溫度(74度),亦會(huì)影響產(chǎn)物的特異性.②G+C的含量一般為40％-60％.③四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布,不要有連續(xù)3個(gè)以上的相同嘌吟或嘧啶存在.尤其是引物3'端,不應(yīng)有連續(xù)3個(gè)G或c,否則會(huì)使引物與核酸的G或c富集區(qū)錯(cuò)誤互補(bǔ),而影響PCR的特異性.④引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列而引起自身折疊,起碼引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp.⑤兩引物之間不應(yīng)互補(bǔ),尤其是它們的3'端不應(yīng)互補(bǔ).一對(duì)引物之間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基有互補(bǔ)性,以免產(chǎn)生引物二聚體.④引物與非特異靶區(qū)之間的同源性不要超過(guò)70％或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源,否則導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增.①引物3'端是引發(fā)延伸的點(diǎn).因此不應(yīng)錯(cuò)配.由于A(yíng)TCG引起錯(cuò)配有一定規(guī)律,以引物3'端A影響最大,因此,盡量避免在引物3'端第一位堿基是A.引物3'端也不要是編碼密碼子的第三個(gè)堿基,以免因?yàn)槊艽a子第3位簡(jiǎn)并性而影響擴(kuò)增特異性.⑧引物5'端可以修飾,包括加酶切位點(diǎn),用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛等標(biāo)記,引入突變位點(diǎn),引入啟動(dòng)子序列,引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列等,引物的設(shè)計(jì)最好以電腦軟件進(jìn)行指導(dǎo).
反應(yīng)體系中,引物濃度一般要求在O.1-0.5μmol之間.濃度太高,容易生成引物二聚體,或非特異性產(chǎn)物.
引物Tm值與退火溫度有關(guān),計(jì)算公式為：Tm=4(G+C)+2(A+T).引物Tm值最好在55-80℃范圍,以接近72℃為最好.
(三)耐熱的TaqDNA聚合酶
1976年Chien分離出熱穩(wěn)定聚合酶,1986年Erlich分離并純化了適于PCR的Tq熱穩(wěn)定性聚合酶,為PCR成為實(shí)用技術(shù)奠定了基礎(chǔ),現(xiàn)已用基因重組生產(chǎn).日前可用于PCR的聚合酶有多種：有從水生棲熱菌中提取的Taq酶、從嗜熱棲熱苗中獲得的Taq酶、從Litoralis棲熱球菌中分離的VENT酶、及從酸熱浴硫化裂片苗中分離的Sac酶,而以Taq酶用得最廣泛.Taq DNA聚合酶分子量為94kD,75℃時(shí)酶比活性為150bs/酶分子,反應(yīng)溫度過(guò)高或過(guò)低均影響其延伸率,Taq蕾有很高的耐熱穩(wěn)定性.實(shí)驗(yàn)表明,在92.5℃、95℃、97.5℃時(shí),其半衰期分別為40min、30min和5min.
純化的Taq酶在體外無(wú)3'-5'外切酶活性,因而無(wú)校正閱讀功能,在擴(kuò)增過(guò)程可引起錯(cuò)配.錯(cuò)配堿基的數(shù)量受溫度、Mg2+濃度和循環(huán)次數(shù)的影響.通常,30次循環(huán)Taq酶的錯(cuò)配率約為0.25％,高于Klenow酶的錯(cuò)配率.Taq酶在每一次循環(huán)中產(chǎn)生的移碼突變率為1/30000,堿基替換率為1/8000.應(yīng)用低濃度的dNTP(各20μmol／L)、1.5mmol/L的Mg2+濃度、高于55℃的復(fù)性溫度,可提高Taq酶的忠實(shí)性,此時(shí)的平均錯(cuò)配率僅為5x10^-6次/（核苷酸*循環(huán)）.
Taq酶具有類(lèi)似于末端轉(zhuǎn)移酶的TdT的活性,可在新生成的雙鏈產(chǎn)物的3'端加上—個(gè)堿基,尤其是dATP最容易加上.因此,欲將PCR產(chǎn)物克隆到載體上,可以用兩種處理辦法：一是構(gòu)建dT-載體；二是用Klenow酶將3'端的A去掉,即在PCR反應(yīng)后,先在99℃加熱10min滅活Taq酶,調(diào)整Mg2+濃度至5-10mmol/L,加入1-2U Klenow片段,室溫下作用15-20min,3'端的A即被切去,
Taq酶還具有反轉(zhuǎn)錄活性.在2-3mmol/L Mg2+濃度下68℃時(shí)出現(xiàn)類(lèi)似反轉(zhuǎn)錄酶的活性.若有Mg2+存在,則反轉(zhuǎn)錄活性更佳,利用這一活性,可直接用于RNA-PCR,尤其是短片段的擴(kuò)增.
以往用Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增,一般只能擴(kuò)增小于400bp的DNA片段,經(jīng)過(guò)對(duì)酶的結(jié)構(gòu)與功能的改造,以及PCR方法學(xué)的改進(jìn),現(xiàn)已能擴(kuò)增20kb以上的DNA分于.
Taq酶在PCR反應(yīng)中加入的量也很重要,太少當(dāng)然不好,太多一方面浪費(fèi),同時(shí)也導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增,通常每lOOμl反應(yīng)液中含1-2.5U Taq酶為好.最好在0.5-5U范圍內(nèi)確定最佳酶濃度.另一個(gè)問(wèn)題是,雖然Taq酶是熱穩(wěn)定性較好的工具酶,也應(yīng)注意在-20℃貯存.
(四)緩沖液
緩沖液提供PCR反應(yīng)合適的酸堿度與某些離子,常用10-50mmol/L.Tris-HCI(pH8.3-8.8)緩沖液.緩沖液中含有50mmol/L KCl有利于引物的退火.有人并加入小牛血清白蛋白(100μg/L)或明膠(0.0％)或Twen20(0.05％-0.1％)或二硫基蘇糖醇(DDT,5mmol/L)等,認(rèn)為這些物質(zhì)可以保護(hù)Taq酶.
(五)Mg2+
Taq酶的活性需要Mg2+.Mg2+濃度過(guò)低,Taq酶活力顯暑降低；Mg2+濃度過(guò)高,又使酶催化非特異性擴(kuò)增.Mg2+濃度還影響引物的退火、模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度、引物二聚體的生成等.Taq酶的活性只與游離的Mg2+濃度有關(guān),而PCR反應(yīng)體系中,dNTP、引物、DNA模板等中的所有磷酸基團(tuán)均可與Mg2+結(jié)合而降低Mg2+的游離濃度.因此,Mg2+的總量應(yīng)比dNTP的濃度高0.2-0.25mmol/L.如果反應(yīng)體系中含有EDTA等螯合劑,也可結(jié)合掉一部分Mg2+.
為了獲得Mg2+的最佳濃度,可用下面的優(yōu)化法.首先在PCR緩沖液小不加入Mg2+,從配置的10mmol/L的Mg2+儲(chǔ)存液中取一定量加入到各反應(yīng)管中,開(kāi)始以0.5mmol/L的濃度梯度遞增(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,……5.0mmol/L),由PCR反應(yīng)后的電泳結(jié)果可確定Mg2+大概濃度范圍,再在該濃度的上下以0.2mmol/L遞增與遞減幾個(gè)濃度來(lái)精確確定Mg2+最適濃度.
(六)dNTP
dNTP為PCR反應(yīng)的合成原料.每種dNTP濃度應(yīng)相等,通常的濃度范圍為20-200mol/L,在此范圍內(nèi),PCR產(chǎn)物的量、反應(yīng)的特異性與忠實(shí)性之間的平衡最佳.例如,當(dāng)每種dNTP為20μmol/L時(shí),理論上可以產(chǎn)生2.6μg的400bp的DNA.使四種dNTP的濃度保持在其Km值(10-15μmol/L)以上,可保持堿基摻入的忠實(shí)性；若dNTP的濃度大于50mmol/L,則可抑制Taq酶的活性.
(七)反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)
1．變性溫度與時(shí)間
PCR反應(yīng)中變性這一步很重要,若不能使模板DNA和PCR產(chǎn)物完全變性,PCR反應(yīng)就不能成功,DNA分子中G+C含量愈多,要求的變性溫度愈高.太高的變性溫度和時(shí)間又會(huì)影響Taq酶的活性,通常的變性溫度和時(shí)間分別為95℃、30s,有時(shí)用97℃、15s.雖然DNA鏈在變性溫度時(shí)兩鏈分離只需幾秒鐘,但反應(yīng)管內(nèi)部達(dá)到所需溫度還需要一定的時(shí)間,團(tuán)此要適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間.為了保證模板DNA能徹底變性．最好為7-10min,然后在以后的循環(huán)中,將變性步驟設(shè)為95℃/min.
擴(kuò)增100-300bp短片段時(shí),還呵以用快速的兩步PCR法,即變性(94-97℃)、退火及延長(zhǎng)(55-75℃).
為防止在變性溫度時(shí)反應(yīng)液的蒸發(fā),可在反應(yīng)管內(nèi)加入1-2滴液體石蠟.
2．復(fù)性溫度和時(shí)間
復(fù)性溫度決定PCR的特異性,合適的復(fù)性溫度應(yīng)低于引物Tm值的5℃.退火溫度過(guò)低,引起非特異性擴(kuò)增；增高退火溫度,可提高擴(kuò)增的特異性,因此要嚴(yán)格規(guī)定退火溫度.退火反應(yīng)時(shí)間一般為1min.
在PCR開(kāi)始的頭一次循環(huán)時(shí),反應(yīng)從遠(yuǎn)低于Tm值的溫度開(kāi)溫,由于Taq酶在低溫時(shí)仍具有活性,這時(shí)就可能因引物與模板非特異性配對(duì)面出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物或出現(xiàn)引物二聚體 然后在以后整個(gè)PCR反應(yīng)中,非特異性產(chǎn)物反復(fù)擴(kuò)增,而使PCR嚴(yán)重失敗.為了盡量消除這種非特異性擴(kuò)增,可以使用熱起動(dòng)的方式,熱起動(dòng)方法有幾種：一種方法是在PCR系統(tǒng)中加入抗Taq酶抗體.抗體與Taq酶結(jié)合,使Taq酶活性受抑制.因此在開(kāi)始時(shí),雖然溫度低,引物可與與模板錯(cuò)配,但因Taq酶沒(méi)有活性,不會(huì)引起非特異性擴(kuò)增；當(dāng)進(jìn)行熱變性時(shí),抗體在高溫時(shí)失活,Taq酶被釋放,就可發(fā)揮作用,在以后的延伸步驟進(jìn)行特
異的DNA聚合反應(yīng).另一種熱起動(dòng)法是用石蠟將Taq酶與PCR反應(yīng)系統(tǒng)分隔,因此一開(kāi)始在室溫條件下也沒(méi)有非特異性擴(kuò)增.當(dāng)升溫到熱變性溫度下,石蠟熔化,Taq酶與PCR反面系統(tǒng)混合,從而在以后的步驟中發(fā)揮作用.使用熱起動(dòng)可以提高PCR擴(kuò)增的特異性.
3．延伸溫度與時(shí)間
延伸溫度一般為72℃左右,此時(shí)Taq酶活性為每秒鐘摻入核苷酸35-100個(gè),2kb的片段用1min已足夠,若DNA片段較長(zhǎng),擴(kuò)增時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng).延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)又可引起非特異性擴(kuò)增.
4．循環(huán)次數(shù)
循環(huán)次數(shù)主要取決于最初靶分子的濃度,例如在初始靶分子為3x10^5、1.5x10^4、1x10^3和50拷貝數(shù)時(shí),循環(huán)數(shù)可分別為25-30、30-35、35-40從40-45.過(guò)多的循環(huán)次數(shù)會(huì)增加非特異性產(chǎn)物量及堿基錯(cuò)配數(shù).PCR反應(yīng)后期,擴(kuò)增產(chǎn)物的增加并不成為指數(shù)方式,稱(chēng)為平臺(tái)效應(yīng).平臺(tái)效應(yīng)可能與下列因素有關(guān)：dNTP與引物濃度降低,酶對(duì)模板的比例相對(duì)降低,多次循環(huán)后酶活力降低,產(chǎn)物濃度增高后變性不完全而影響引物延伸.
(八)PCR儀
有多種進(jìn)口與國(guó)產(chǎn)PCR儀.儀器的升降溫方式可有氣體加溫、水加溫及電熱塊加溫等.溫度、循環(huán)次數(shù)及時(shí)間等參數(shù)現(xiàn)多用電腦控制.可根據(jù)需要選擇儀器.
由于PCR方法高度靈敏,少量的靶分子即可擴(kuò)增至無(wú)限數(shù).因此要防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染環(huán)境而引起以后的PCR假陽(yáng)性.為此,應(yīng)將PCR儀及PCR產(chǎn)物檢測(cè)等過(guò)程與標(biāo)本制備及PCR反應(yīng)管的制備盡量在空間分開(kāi),最好在不同的房間進(jìn)行.通?？蓪?shí)驗(yàn)空間分為標(biāo)本處理區(qū)、反應(yīng)混合制備和PCR擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)等.
PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系
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10×擴(kuò)增緩沖液 　 10ul
　　　4種dNTP混合物 　 各200umol/L
　　　引物 　　　　 　 各10～100pmol　
　　　模板DNA 　　　 　 0.1～2ug　
　 　 Taq DNA聚合酶 　 2.5u　
　　　Mg2 　　　　　　 1.5mmol/L
　　　加雙或三蒸水至 　 100ul