摘要：

一、樣品RNA的抽提；

二、RNA質(zhì)量檢測；

三、樣品cDNA合成；

四、梯度稀釋的標準品及待測樣品；

五、制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的模板；

六、待測樣品的待測基因?qū)崟r定量PCR；

七、實時定量PCR使用引物列表。

1.樣品RNA的抽提
　　　①取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。
　　　②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
　　　③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
　　　④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀?；靹蚝?，4℃下7000rpm離心5分鐘。
　　　⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
　　　⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。

2.RNA質(zhì)量檢測
　　　1）紫外吸收法測定
　　　先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。
　　　① 濃度測定
　　　A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為：A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 μg/ml。具體計算如下：
　　　RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495μl的TE中，測得A260 = 0.21
　　　RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
　　　取5ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35 μl，剩余RNA總量為：
　　　35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
　　　②純度檢測
　　　RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。
　　　2）變性瓊脂糖凝膠電泳測定
　　　①制膠
　　　1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
　　　10×MOPS電泳緩沖液
　　　濃度 成分
　　　0.4M MOPS，pH 7.0
　　　0.1M 乙酸鈉
　　　0.01M EDTA
　　　灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。
　　　②準備RNA樣品
　　　取3μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。
　　　③電泳
　　　上樣前凝膠須預電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2–3cm。
　　　④紫外透射光下觀察并拍照
　　　28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機拍下電泳結果。

3.樣品cDNA合成
　　?、?/strong>反應體系
　　　序號 反應物 劑量
　　　1 逆轉(zhuǎn)錄buffer 2μl
　　　2 上游引物 0.2μl
　　　3 下游引物 0.2μl
　　　4 dNTP 0.1μl
　　　5 逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 0.5μl
　　　6 DEPC水 5μl
　　　7 RNA模版 2μl
　　　8 總體積 10μl
　　　輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
　　　②混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘。
　　　③取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。

4.梯度稀釋的標準品及待測樣品
　　　管家基因（β-actin）實時定量PCR
　　　①β-actin陽性模板的標準梯度制備 陽性模板的濃度為1011，反應前取3μl按10倍稀釋（加水27μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。
　　　②反應體系如下：
　　　標準品反應體系
　　　序號 反應物 劑量
　　　1 SYBR Green 1 染料 10μl
　　　2 陽性模板上游引物F 0.5μl
　　　3 陽性模板下游引物R 0.5μl
　　　4 dNTP 0.5μl
　　　5 Taq酶 1μl
　　　6 陽性模板DNA 5μl
　　　7 ddH2O 32.5μl
　　　8 總體積 50μl
　　　輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
　　　管家基因反應體系：
　　　序號 反應物 劑量
　　　1 SYBR Green 1 染料 10μl
　　　2 內(nèi)參照上游引物F 0.5μl
　　　3 內(nèi)參照下游引物R 0.5μl
　　　4 dNTP 0.5μl
　　　5 Taq酶 1μl
　　　6 待測樣品cDNA 5μl
　　　7 ddH2O 32.5μl
　　　8 總體積 50μl
　　　輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
　　　③制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機，反應條件為：93℃2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環(huán)。

5.制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的模板
　　　①針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應。
　　　反應體系：
　　　序號 反應物 劑量
　　　1 10× PCR緩沖液 2.5 ul
　　　2 MgCl2 溶液 1.5 ul
　　　3 上游引物F 0.5 ul
　　　4 下游引物R 0.5 ul
　　　5 dNTP混合液 3 ul
　　　6 Taq聚合酶 1 ul
　　　7 cDNA 1 ul
　　　8 加水至總體積為 25ul
　　　輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
　　　35個PCR循環(huán)（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）； 72oC延伸5分鐘。
　　　②PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。
　　　③將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋: 將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋: 設定PCR產(chǎn)物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。

6.待測樣品的待測基因?qū)崟r定量PCR
　　　①所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體系。
　　　體系配置如下：
　　　序號 反應物 劑量
　　　1 SYBR Green 1 染料 10 ul
　　　2 上游引物 1ul
　　　3 下游引物 1ul
　　　4 dNTP 1ul
　　　5 Taq聚合酶 2ul
　　　6 待測樣品cDNA 5ul
　　　7 ddH2O 30ul
　　　8 總體積 50 ul
　　　輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
　　　②將配制好的PCR反應溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為：93℃2分鐘預變性，然后按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個循環(huán)，最后72℃7分鐘延伸。

7.實時定量PCR使用引物列表
　　　引物設計軟件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補；引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結構；引物不在模板的非目的位點引發(fā)DNA 聚合反應(即錯配)。
8.電泳
　　　各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應。PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，GoldView?染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。